Полиферменттер және изоферменттер

Фермент молекуласының кеңістіктегі өлшемдері әртүрлі және субстратпен салыстырғанда үлкен болады. Көптеген ферменттер моле­кулалық массасы өте үлкен бірнеше суббірліктерден тұратын белок-мультиэнзимдерден (полифермент) құралған болады. Мысалы, глутаматдегидрогеназа молекуласы алты суббірліктен (әрбірінің м. м. = 12 кДа), тұрады, ал олардың өздері ферменттің толық молекуласы (м. м. = 1млн Да) төрт фрагменттен (әрбірі м. м. = 250 кДа) құралған. Уреаза ферменті сегіз суббірліктен (әрбірінің м. м. = 60 кДа) тұрады. Суб­бірліктердің (протомер) мультимерлердегі (мультиэнзим) бір бірімен байланысуы әртүрлі.

Полифермент молекуласы екі түр­лі бір бірінен ү.р.қ. немесе т.р.қ. ғана кейбір кішкене өзгерістері бар А типті және Б типті суббірліктен құрасты­рылған.

Суббірліктерге диссоциациялану фермент активтілігімен бірге әсер ету ерекшеліктерін де тежеуі мүмкін. Бұл жағдайда бір суббірлік аллостерлік реттегіш ретінде келесі суббірлікке әсер етеді. Суббірліктердің фермент­тік әсерлері бір біріне жегілген тәріз­дес өтеді деп қабылданған. Сондықтан реакцияның энергиялық тиімсіз стадиясы келесі суббірліктен бөлінген энергияға жегілген болады. Торшаларда өтетін ферментативтік реакциялар көптеген ферменттердің (әртүрлі) бірлесіп әсер етуі арқылы өтеді. Бұл жүйелерді бірнеше ферменттерден тұратын комплекс деп қарастыруға болады. Пирожүзім қышкылының дегидрогеназасы әр­түрлі коферменттермен (тиаминпирофосфат, ФАД, липой қышқылы, НАД, КоА) байланысқан үш белок-ферменттен тұратын полифермент­тік комплекс (м.м. ≈ 4,500 кДа). Полиферменттік комплекстер торша мембранасы немесе органелласымен байланысқан болады. Сондықтан, тыныс алу тізбегі жүйесінің ферменттерінің (олар сутегі мен электрон­ды субстраттан оттегіге тасымалдайды) бір бөлігі митохондрияның ішкі мембранасында орналасқан болады. Ферменттердің орналасуы реті белгілі тәртіп бойынша реакцияның жүру және кезектесу бағыты бойынша орналасады. Тотығу-тотықсыздану реакцияларының, ҮКҚ циклі ферменттері-митохондрияда, белок биосинтезі ферменттері-рибосома мен гиалоплазмазада (АҚ активтеуші), нуклеин қышқылы ферменттері-ядрода шоғырланған болады.

Полиферменттік жүйелердің ұйымдасуы. Ферменттік ката­лиздің заттардың өзгертуімен өтетін биохимиялық реакциялар жиынын бір процесс ретінде өткізеді. Торшаның, ұлпалардың мүшелердің ағза­ның өмір сүріне қажетті заттарды осы жолдармен қамтамассыз етеді.

Полиферменттік жүйелердің құрылысы келесі жолдармен құралады:

— 1. қызметтік құрылым бойынша ұйымдасқан. Бұл жағдайда әртүрлі типтегі фер­менттер катализдік процесстің жүру барысында ерітіндіде бір бөлікте болады;

— 2. құрылымдық ұқсастығы бойынша ұйымдасқан. Ұқсас құрылым­дағы белоктар бір бірімен өзара әсерлесіп ферменттердің құрылымдық жүйесін құрайды;

— 3. аралас типті құрылымдар бойынша ұйымдасқан. Екі типтегі құ­рылым (А және Б типтері) әртүрлі комбинацияларда құралады.

Полиферменттік жүйеде алғашқы фермент катализдеген реакция өнімі келесі фермент үшін субстрат болады. Бұл процесс полифермент жүйесіндегі әрбір фермент толық әсерлесуі өткенше жалғасады.

Изоферменттер (изоэнзим, изозим) — мультимердегі А және Б типтегі суббірліктердің әртүрлі комбинациясының нәтижесінде пайда болған изомерлер. Мысалы, А және Б типтегі протомерден 5 изомер (АААА; АААБ; ААББ; АБББ; ББББ) алуға болады.

Қазіргі кезде сүт қышқылының (лактат) пирожүзім қышқылына айналуына немесе кері бағытта катализдейтін лактатдегидрогеназа ферменті жақсы зерттелген. Лактатдегидрогеназа әртүрлі гендермен код­талған Н (ағылш. heart — жүрек) және М (ағылш. muscle — бұлшық ет) типтеріндегі жүрек пен бұлшықеттерде басым болатын суббірлік­терден құралған. ЛДГ₁ — (НННН), ЛДГ₂ — (НННМ), ЛДГ₃ — (ННММ), ЛДГ₄ — (НМММ), ЛДГ₅ — (ММММ) изомерлері физико-химиялық қа­сиеттері бойынша (м. м., электрофореттік қозғалысы, изоэлектрлік нүктесі, аминоқышқылдық құрамы мен кезектесуі реті, ұлпаларда, мүшелерде шоғырлануы) ерекшеленеді. Мысалы, ЛДГ₁, ЛДГ₂ — анодқа жылжиды (анодтық фракция) аэробтық процесстерге қатысады, ЛДГ₄, ЛДГ₅ — катодқа жылжиды (катодтық фракция) анаэробтық процесстерге қатысады. ЛДГ₁, ЛДГ₂ — жүрек бұлшықеті, бүйректе, мида және эритроциттерде басым болса, ЛДГ₄, ЛДГ₅ — қаңқа бұлшық еттері, бауыр, өкпеде, ЛДГ₃ — көк бауырда кейбір эндокриндік бердерде кездеседі.

Иммобилденген ферменттер. Соңғы кездері медицина, фармация салаларында жасанды иммобилденген ферменттер кең қолданылады. Ферменттерді әртүрлі матери­алдарға (полиакриламид, шыны, силастик, полистерол) бекітіп иммобилдеу (байланыстыру) арқылы ерімейтін жасанды катализатор жасағанда ферменттер активтілігін сақтап, сонымен бірге, олардың әсерінің ұзақ­тығын, мықтылығын, тұрақтылығын арттырады. Бұл технология қазіргі кезде өндірісте, тұрмыста кең қолданылуда.

Әртүрлі субторшалы құрылымдардың ферменттік құрамы. Ферменттер торшада және оның органеллаларында атқаратын қыз­меті, реакциясына сәйкес түрде жинақталғаны себепті компартменттерге бөлінеді, ол жалпы түрде компартментализация деп аталады.

Ферменттердің компартменттігі келесі түрде беріледі:

— торшаның ядросының ферменттері: НАД-пирофосфорилаза, ДНК-полимераза, РНК-полимераза, оротидилатпирофосфорилаза, ури­динкиназа, 5'-нуклеотидаза, УДФ-глюкозопирофосфорилаза, гликолиз ферменттері, аминоқышқылдарды активтеуші ферменттер, аминоқыш­қылдар трансферазасы, аденозиндезаминаза, лейцинаминопептидаза, уроканиназа. Барлығы 13 фермент.

— ядро қабығының ферменттері: цитохромоксидаза, глутаматдегидрогеназа, НАД·Н-цитохром-с-редуктаза, арилсульфатаза А және Б, АТФ-аза (Mg²⁺), ацетилэстераза, метилбутириназа. Барлығы 8 фермент.

— митохондрия ферменттері: АТФ-аза (Mg²⁺, Na⁺, K⁺, Ca²⁺), сукцинатдегидрогеназа, цитохромоксидаза, β-оксибутиратдегидрогеназа, α-глицерофосфатдегидрогеназа, ацил-КоА-β-дегидрогеназа, НАД·Н-дегидрогеназа, май қышқылын тотықтырушы ферменттер, май қыш­қылдарын синтездеуші ферменттер, Кребс циклінің 5 ферменті, миокиназа, моноаминоксидаза, α-кетоглутаратдегидрогеназа, сукцинатцитохром–С-редуктаза, аспартатаминотрансфераза, орнитинкарбомоилтрансфераза, НАД·Н-цитохром-В₅-редуктаза, НАД·Н-оксидаза, пируватдегидрогеназа, пролиноксидаза, липоамиддегидрогеназа, кинуренингироксилаза, аденилаткиназа, нуклеозиддифосфокиназа. Барлығы 28 фермент.

— лизосома ферменттері: барлығы 35 фермент — катепсиндер, коллагеназалар, β-галактозидазалар, β-глюкоуронидазалар, гиалурони­даза, лизоцим, нейраминидазалар, ДНК-аза және РНК-аза, қышқылдық фосфатаза, фосфолипазалар, қышқылдық пирофосфотаза және қыш­қылдық АТФ-аза.

— пероксисома ферменттері: каталаза, пероксидаза, уратоксидаза, D-, L- аминоқышқылдарының оксидазалары.

— эндоплазмалық ретикулум ферменттері: НАД·Н-цитохром-с-ре­дуктаза, глюкозо-6-фосфатаза, нуклеотидтерінің дифосфатазасы, сілті­лік фосфатаза, 5'-нуклеотидаза. Барлығы 20 фермент.

— гиалоплазма ферменттері: гликолиз ферменттері, аденозиндезаминаза, гексозодифосфатаза, лактатдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, глутатионредуктаза, аспартатаминотрансфераза, аланинамино­трансфераза, глюкокиназа, глюконфосфорилаза, альдолаза, аконитаза. Барлығы 18 фермент.

Ферменттерді бөліп алу.Ұлпаларда ферменттер өте аз мөлшерде кездеседі. Ферменттерді бөліп алу үшін әртүрлі әдістерді қолданады. Көптеген ферменттерді адам мен жануарлардың асқорыту сөлдерінен алады (ол ферменттердің концентратты сулы ерттіндісі). Ұлпаларды суықта ыдырату (ұсақтау, кварц, құмдарымен үйкелеу, гомогендеу) арқылы экстракциялап (спирт, тұзды ерітінді және т.б.) ферменттерді бөледі. Адсорбция (Данилевский) тәсілі, ионалмасу хроматографиясы, центрифугалау, электрофорез әдістерін кең қолданады.

Фермент активтілігін анықтау. Бөліп алынған ферменттердің тазалығы оның активтілігі арқылы бағаланады. Егер фермент активтілігі ары қарай тазартқанда өзгермейтін болса, оны гомогенді таза фермент ретінде қабылдайды. Ферменттерді биологиялық материалдардан бөліп алу қиындық туғызады. Сондықтан ферменттің сандық мөлшерін оның субстратқа әсер еткендегі активтілігі арқылы жанама түрде анықтайды.

Химиялық реакцияның жылдамдығы фермент активтілігіне тығыз байланысты немесе тәуелді болады. Сол себептен ферменттің сандық мөлшерін екі түрлі жолмен келесі тендеулер арқылы анықтауға болады:

1. Фермент әсер ететін субстраттың, белгілі бір сандық мөлшерінің белгілі бір уақытта азаюы арқылы;

K = ΔS / Δt,

K — реакция жылдымдығының тұрақтысы, ΔS — субстрат мөлшері, Δt — уақыт өлшемі.

2. Реакция өнімінің мөлшерінің белгілі бір уақыт өлшемінде көбеюі арқылы

K = ΔP / Δt,

ΔP — реакция өнімі.

Бұл екеуі де абсолютті теңдей шамалар. Себебі неше субстрат ре­акцияға түссе сонша реакция өнімі түзіледі (массалардың сақталу заңы бойынша). Сондықтан кезкелгенін пайдалануға болады.

Фермент активтілігіне бірнеше факторлар әсер етеді. Оларды жалпы түрде үш топқа бөледі:

1. Торшадағы фермент мөлшерлері немесе оның биосинтезінің дең­гейіне тәуелділік;

2. Ферментативті реакциялардың жылдамдығына әсер етуші фак­торларға қатысты тәуелділік — субстраттың бар болуы, апофермент конформациясына әсер етуші активатор, ингибитор, кофакторлардың, денатурлаушы әсерлердің, температура, гидратация, рН, электролит­тердің болғандығы;

3. Ферменттердің шоғырлануы, мембрана өткізгіштігі, субстраттың фермент әсеріне ыңғайлылығы, реакция өнімдерінің әкетілу жылдам­дығына байланысты тәуелділік.

Фермент активтілігінің өлшем бірлігі. Халықаралық био­хи­мия­лық одақтың ферменттер бойынша комиссиясы 1962 ж. ферменттер мөлшерінің мәндерінің шамаларын көрсететін жалпы ережені ұсынды. Бұл ереже бойынша ферменттердің өзіндік активтілігі (Е) ретінде оның (Т = 25° С) 1 минутта субстраттың 1 микромолін катализдеуге (немесе 1 микромоль реакция өніміне айналуы) кеткен мәні алынады.

1 ХБ = 1 мкмоль/мин

ХБ — халықаралық бірлік (орыс тілінде МЕ-международная единица).

Сонымен бірге СИ жүйесінде фермент активтілігін — катал бірлігі бойынша өлшеу қабылданған. Катал бұл 1 моль субстратты (немесе 1 моль реакция өнімі түзілуін) 1 секундта катализдеуге кеткен фермент активтілігінің мәні

1 катал = 1 моль/с

Клиникалық биохимиялық зерттеулерде фермент активтілігіне әсер ететін биологиялық сұйықтықтың көлеміне (V) қатысты каталдың литрге қатынасы (катал/литр) алынады.

Фермент активтілігін анықтаудың қазіргі заманғы әдістеріне спектрофотометрлік, флюориметрлік, полярографикалық, колориметрлік және т. б. тәсілдер жатқызылады.