Годовые этапы исследования

Этап 2013 г.

1. Изучение эффективности стимуляции противоопухолевого иммунного ответ в зависимости от способа доставки антигенного материала и его характеристики (лизат, ДНК-конструкция, мРНК), а также клеточных и молекулярных механизмов регуляции и реализации противоопухолевого иммунного ответа дендритными клетками (изучение фенотипических и функциональных свойств ДК у больных с онкопатологией, исследование in vitro возможности коррекции имеющихся дисфункций с помощью цитокинов (IL-12, IL-18) (отв. исполнитель - Курилин В.В.)

2. Оценить цитотоксическую активность ИФН-ДК больных злокачественными глиомами головного мозга против первичных опухолевых клеток и оценить роль трансмембранной формы TNFα (tm TNFα) в реализации цитотоксической активности ДК против TRAIL-резистентных опухолевых клеток (отв. исполнитель - Леплина О.Ю.).

3. Провести сравнительное исследование проапоптогенной активности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК против CD4 и CD8 Т-клеток, активированных аллоантигенами в смешанной культуре лимфоцитов (отв. исполнитель - Леплина О.Ю.).

4. Изучение механизмов самоподдержания Т-клеток памяти in vitro (отв. исполнитель - Селедцова Г.В.)

Этап 2014 г.

1. Исследование фенотипических и функциональных свойств ДК при развития аутоиммунных процессов у больных РА (оценка количественных и качественных показателей дендритных клеток и их подтипов в периферической крови у больных РА) и изучение экспериментальной модели ДК-индуцированного ревматоидного артрита (изучение особенностей его развития по сравнению с классическими экспериментальными моделями) (отв. исполнитель - Курилин В.В.).

2. Охарактеризовать экспрессию молекулы CCR7 и миграционную активность ИФН-ДК и ИЛ4-ДК доноров, а также ИФН-ДК больных злокачественными глиомами/лимфомамив ответ на стимуляцию хемокинами CC-семейства CCL19 (MIP-3β) и CCL21 и оценить влияние иммуноактивных факторов на миграционную активность ДК. (отв. исполнитель - Леплина О.Ю.)

3. Изучение свойств Т-клеток памяти у больных рассеянным склерозом и в условиях экспериментальной модели рассеянного энцефаломиелита.. Исследование возможности модуляции функциональной активности Т-клеток памяти цитокинами и TLR-лигандами. . (отв. исполнитель - Селедцова Г.В.)

Этап 2015 г.

1. Изучение различных подходов иммунокоррегирующей терапии экспериментального ревматоидного артрита, индуцированного ДК, а также отработка протокола получения дендритных клеток с толерогенным фенотипом у больных РА. (отв. исполнитель - Курилин В.В.)

2. Исследовать переносимость и клиническую эффективность ДК вакцин на основе ИФН-ДК в лечении больных глиобластомой. (отв. исполнитель - Леплина О.Ю.)

3. Изучение свойств Т-клеток памяти у больных бронхиальной астмой. Исследование возможности модуляции функциональной активности Т-клеток памяти цитокинами и TLR-лигандами. (отв. исполнитель - Селедцова Г.В.)

Этап 2016 г.

1. Изучение клинической эффективности вакцин на основе ДК, нагруженных опухолевыми антигенами, при лечении онкологических больных (исследовать безопасность, клиническую эффективность и эффективность индукции противоопухолевого иммунного ответа в процессе терапии ДК-вакцинами у онкологических больных; оценить побочные эффекты клеточной иммунотерапии, частоту рецидива и метастазирования опухоли; оценить иммунный статус, продукция цитокинов и цитотоксических молекул) (отв. исполнитель - Курилин В.В.).

2. Провести клинические испытания вакцин на основе ИФН-ДК у больных хроническими вирусными заболеваниями, вызванными вирусами семейства герпес-вирусов и вирусом гепатита В с использованием рекомбинантных вирусных белков (HSV1 gD, HSV2gD, CMV pp65, HBs, HBVCore) (отв. исполнитель - Леплина О.Ю.).

3. Изучить влияние тканевого повреждения (токсическое повреждение почки) на генерацию аутореактивных Т-клеток памяти (отв. исполнитель - Селедцова Г.В.)

4. Изучить влияние аутореактивных Т-клеток памяти на ростовую и дифференцировочную активность низкодифференцированных (стволовых) клеток, в частности, мезенхимальных стромальных клеток (МСК). (отв. исполнитель - Селедцова Г.В.)

Научный коллектив

1. Сенников С.В., зав. лаб., д.м.н., профессор
2. Курилин В.В., с.н.с., к.м.н.
3. Лопатникова Ю.А., с.н.с., к.б.н.
4. Силков А.Н., с.н.с., к.б.н.
5. Шевченко Ю.А., н.с., к.б.н.
6. Хантакова Ю.Н. аспирант
7. Облеухова И.А., м.н.с.
8. Киреев Ф.Д., м.н.с.
9. Фалалеева С.А., аспирант
10. Горева О.П., м.н.с.
11. Садовская В.А., м.н.с.
12. Васильев Ф.Ф., м.н.с.
13. Куликова Е.В., аспирант
14. Альшевская А.А., аспирант
15. Хабарова А.П., лаборант-исследователь
16. Черных Е.Р., зав. лаб., д.м.н., профессор
17. Останин А.А., в.н.с., д.м.н., проф.
18. Хонина Н.А., с.н.с., д.м.н.
19. Леплина О.Ю., с.н.с., к.м.н.
20. Шевела Е.Я., с.н.с., к.м.н.
21. Сахно Л.В., с.н.с., к.б.н.
22. Тихонова М.А., с.н.с., к.б.н.
23. Тыринова Т.В., м.н.с., к.м.н.
24. Баторов Е.В., м.н.с.
25. Смирнова В.Ф., лаб-иссл.
26. Мяснянкина Т.А., лаб-иссл.
27. Кащенко Т.М., лаб-иссл.
28. Борисенкова Н.И., лаб-иссл.
29. Сычева Н.В., н.с. (0,5 ставки)
30. Орловская И.А., зав. лаб., д.м.н., профессор
31. Цырендоржиев Д.Д., в.н.с., д.м.н., профессор
32. Топоркова Л.Б., с.н.с, к.б.н.
33. Феофанова Н.А., м.н.с., к.б.н.
34. Селедцова Г.В., д.м.н. зав.лаборатории.
35. Белогородцев С.Н., с.н.с., к.м.н.
36. Иванова И.П., с.н.с, к.м.н.
37. Кащенко Э.А., н.с., к.б.н.
38. Савкин И.В., н.с.
39. Колесникова О.П. д.м.н., зав. лаб
40. Гаврилова Е.Д. н.с., к.б.н.
41. Скоробогатых Е.В м.н.с.

Объект исследования: здоровые доноры, пациенты со злокачественными глиомами, раком молочной железы, колоректальным раком, раком яичника, туберкулезом, хроническими вирусными инфекциями, пострадавшие от черепномозговой травмы, больные аутоиммунными заболеваниями, мыши (CBAxC57Bl/6-F1, Balb/c, DBA/J, CBA).

Модели: экспериментальный коллаген-индуцированный артрит.

Материалы исследования:

Для решения поставленных задач будут использованы методы выделения, разделения и культивирования иммуннокомпетентных клеток, иммунофенотипирования и определения внутриклеточных молекул цитокинов с использованием проточной цитофлюорометрии, радиометрический метод оценки пролиферативной активности, метод протеомного анализа и ИФА для оценки продукции цитокинов, методы экспериментального моделирования на лабораторных животных аутоиммунных процессов, методы клинического и инструментальной оценки эффективности терапии онкобольных.

ДК будут оцениваться по относительному содержанию миелоидных («CD11c⁺DC») и плазмацитоидных («CD123⁺DC») дендритных клеток в периферической крови условно-здоровых и больных людей, уровень экспрессии маркеров созревания (CD83) и костимуляторных молекул (CD80) хемокина (CCR7) на поверхности дендритных клеток («CD11c⁺DC» и «CD123⁺DC»). Чувствительность ДК, циркулирующих в периферической крови, к факторам их созревания будет определяться по изменению экспрессии поверхностных маркеров созревания на подтипах ДК через 4 ч инкубирования при 37^оС после добавления стимулятора созревания (агонисты TLR). Функциональная активность ДК, в ответ на стимуляторы созревания (агонисты TLR), также будет оцениваться по изменению внутриклеточной продукции цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-4, IL-12, IFN-α) разными подтипами ДК. Оценка иммунного статуса: Т-клетки (CD3⁺CD4⁺, CD3⁺CD8⁺), В-клетки (CD19⁺), NK-клетки (CD3-CD16⁺CD56⁺), NKT-клетки (CD3⁺CD16⁺CD56⁺), активированные Т-клетки (CD3⁺HLA-DR⁺), Трег-клетки (CD4⁺CD25⁺) и экспрессия молекул FoxP3 и CTLA-4. Методы направленной коррекции функциональной активности ДК будут основаны на выделении из периферической крови прилипающей фракции мононуклеарных клеток и культивирование их в присутствии различных ростовых факторов (IL-4, GM-CSF, IL-3, TNF-α, LPS, агонисты TLR) c последующей оценкой функциональной активности полученных ДК (оценка экспрессии CD83, CD80, CCR7 и эндоцитозная активность «CD11c⁺DC» и «CD123⁺DC»). Для доставки антигенного материала внутрь ДК будут использоваться методы пассивной и активной доставки (трансфекция). Эффективность стимуляции противоопухолевого иммунитета будет оцениваться по тесту цитотоксичности (гибели) опухолевых клеток при их совместном культивировании с клетками-эффекторами (мононуклеарные клетки, сокультивируемые со зрелыми ДК, нагруженными опухолевыми антигенами). Механизмы стимуляции противоопухолевого иммунного ответа будет оцениваться по изменению перфорин- и гранзим Б-позитивных CD8⁺лимфоцитов и NK-клеток, по экспрессии FasL и TRAIL-R (DR4, DR5) на мононуклеарных клетках. Определение в кондиционной среде сокультивируемых клеток (мононуклеарных клеток и ДК) содержания иммунорегуляторных цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10, IL-2). Клиническая эффективность и оценка побочных эффектов клеточной иммунотерапии, частоты рецидивов и метастазирования будет оцениваться клиническими, лабораторными (гематологический, биохимический, иммуноферментный), инструментальными (УЗИ, томографический, эндоскопический) методами. Для оценки эффективность индукции противоопухолевого иммунного ответа будут определяться изменения иммунограммы периферической крови (Т-клетки (CD3⁺CD4⁺, CD3⁺CD8⁺), В-клетки (CD19⁺), NK-клетки (CD3-CD16⁺CD56⁺), NKT-клетки (CD3⁺CD16⁺CD56⁺), активированные Т-клетки (CD3⁺HLA-DR⁺), Трег-клетки (CD4⁺CD25⁺) и экспрессия молекул FoxP3 и CTLA-4). Оценка внутриклеточной продукции цитокинов (IFN-γ, IL-4, TNF-α) CD3⁺CD8⁺, CD3⁺CD4⁺ лимфоцитами и, содержания в кондиционной среде иммунорегуляторных цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-6, IL-10, IL-2) в культуре мононуклеарных клеток онкобольных после курса клеточной иммунотерапии. Определение содержания перфорин- и гранзим Б-позитивных CD8⁺лимфоцитов и NK-клеток, экспрессии FasL и TRAIL-R (DR4, DR5) на мононуклеарных клетках. Функциональное состояние ДК будет оцениваться по относительному содержанию миелоидных («CD11c⁺DC») и плазмацитоидных («CD123⁺DC») дендритных клеток в периферической крови условно-здоровых и больных людей, уровень экспрессии маркеров созревания (CD83) и костимуляторных молекул (CD80) хемокина (CCR7) на поверхности дендритных клеток («CD11c⁺DC» и «CD123⁺DC»), экспрессию IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase). За основу экспериментальной модели ДК-индуцированного ревматоидного артрита будет использованы работы Leung B.P и соавт. [10]. Способы клеточной иммунотерапии ДК-индуцированного ревматоидного артрита будут основаны на использовании протоколов получения иммуннокомпетентных клеток с толерогенными свойствами, которые будут отрабатываться в ходе экспериментов (IL-10, TGFb).

Генерация ДК будет осуществляться из прилипающей фракции МНК в присутствии GM-CSF и IFN-α либо IL-4. Цитотоксическая активность ИФН-ДК против первичных опухолевых клеток и TRAIL-резистентных клеток Hep2 будет оцениваться с помощью МТТ-теста и выходу H3-тимидина из лизированных клеток, против активированных Т-клеток – по уровню апоптоза CD4 и CD8 Т-лимфоцитов цитофлюориметрически по связыванию AnnexinV с клеточной мембраной и PI с ДНК клеток. При этом для оценки роли мембранной формы TNFα на поверхности ДК параллельно будет оцениваться экспрессия tmTNFα. Миграционная активность будет оцениваться по экспрессии молекулы CCR7, а также способности ДК проходить через поры мембранного фильтра в Transwell-планшетах. Индукторами миграции будут служить хемотаксические пептиды CCL19 и CCL21, а также растворимые факторы опухолевых клеток. Количество мигрирующих клеток через мембранный фильтр будет анализироваться с помощью проточной цитометрии. Способность ДК здоровых доноров и больных индуцировать сигналы хоминга в Т-клетках будет оцениваться по экспрессии рецепторов CCR2, CCR5 и CCR7 на Т-лимфоцитах при совместном культивировании с ДК. Для нагрузки ДК (при проведении клинических испытаний) планируется использование лизата опухолевых клеток и рекомбинантных вирусных антигенов (HSV1 gD, HSV2gD, HBs, HBVCore,CMV pp65). Эффективность индукции противоопухолевого/противовирусного иммунного ответа будет оцениваться по нарастанию антигенспецифического иммунного ответа на соответствующий рекомбинантный антиген и лизат клеток опухоли.

Исследование свойств Т-клеток памяти будет выполнено с использованием клеток крови больных аутоиммунными и аллергическими заболеваниями и клеток селезенки, лимфоузлов, периферической крови экспериментальных животных с индуцированной патологией ( рассеянный энцефаломиелит, токсическое поражение почек). Выделение чистой популяции лимфоцитов , несущих CD4+CD45RO+ у человека и CD4+CD44+- у мышей ( популяции Т-клеток памяти) будет выполнено методом магнитной селекции с использованием соответствующих АТ. Культивирование Т-клеток памяти будет производиться в бессывороточной среде, с использованием селективных культуральных сред. Для исследования свойств самоподдержания Т-клеток памяти будут использованы цитокины ( ИЛ-7, ИЛ-15) , индукторы апоптоза, TLR-лиганды. Результат будет оценен цитофлюориметрически по изменению количества клеток, несущих маркеры CD45RO, 62L, FOXP3 и др, по содержанию внутриклеточных цитокинов ( IFN-γ, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-15), способности к пролиферации. В модели токсического повреждения почки содержание и свойства аутореактивных Т-клеток памяти будет оценено в условиях стимуляции выделенных Т-памяти антигеном, приготовленным из ткани почки. Для стимуляции регенерации почечной ткани в этой модели используются мезенхимальные стволовые клетки. В условиях совместного культивирования МСК с Т -памяти in vitro будет оценена возможность взаимовлияния и взаиморегулирования этих популяций друг на друга, оцененная по динамике поверхностных маркеров и апоптотических молекул.

Аппаратура и оборудование:

1. проточный цитофлюориметр с функцие сортировки клеток BD FACSAria

2. проточный цитофлюориметр BD FACSVerse

3. проточный цитофлюориметр BD FACS Calibur

4. проточного анализатора Bio-Plex Protein Assay System

5. многоканальный спектрофотометр

6. программный замораживатель

7. мультимодальный планшетный ридер LB 941 TriStar фирмы Berthold Technologies

8. ламинарные боксы для культуральных работ

9. мультимодальная центрифуга Jouan 23 iM

10. CO₂-инкубатор клеток

11. система очистки воды (Millipore)

12. спектрофотометр NanoDrop ND-2000C

Научная новизна:

Будет изучено функциональное состояние дендритных клеток в норме и при патологии (онкология, инфекционный и аутоиммунный процесс), а также клеточные и молекулярные механизмы регуляции ДК, разработка на этой основе методов направленной коррекции функциональной активности ДК. Будет изучена взаимосвязь между функциональным состоянием дендритных клеток и эффективностью стимуляции противоопухолевого иммунного ответа у онкологических больных. Будут получены новые данные о цитотоксическом потенциале ИФН-ДК у больных злокачественными глиомами против первичных опухолевых клеток, роли tmTNFα в реализации цитотоксической активности ДК и ее нарушении, проведены сравнения проапоптогенной активности различных типов ДК против активированных Т-клеток. Впервые будут получены сравнительные характеристики миграционной активности различных типов ДК и их способности к индукции сигналов хоминга в Т-лимфоцитах, в том числе у доноров и больных злокачественными заболеваниями, а также новые данные о влиянии растворимых факторов опухолевых клеток на функции ИФН-ДК. В результате клинических испытаний будут получены новые данные о переносимости и клинической эффективности ИФН-ДК в лечении злокачественных глиом головного мозга и хронических вирусных инфекций. При этом оценка параметров иммунитета в динамике терапии ИФН-ДК позволит получить новые сведения о степени сопряженности клинического эффекта с генерацией противоопухолевого и противоинфекционного иммунного ответа у данной категории пациентов. Впервые будет исследована эффективность генерации толерогенных ДК на основе ИФН-ДК и оценена стабильность их фенотипа.

В результате исследования будет оценена клиническая эффективность клеточной иммунотерапии с применением вакцин на основе дендритных клеток, нагруженных опухолевыми антигенами, у онкологических больных.

Будут разработаны способы иммунокорригирующей терапии в модели ревматоидного артрита, индуцированного ДК.

Кроме того, впервые будут изучены условия и возможности самоподдержания Т-клеток памяти in vitro, определены условия, необходимые для наращивания Т-клеток памяти с определенными характеристиками. Изучены условия и возможности изменения фенотипа Т-памяти при культивировании. В ходе выполнения работы будут намечены подходы к модуляции апоптотической активности Т-клеток памяти на молекулярном уровне. Впервые будут изучены свойства Т-клетки памяти в условиях стимуляции регенерации, определен популяционный состав этих клеток.

Ожидаемые результаты:

Полученные данные о свойствах ДК у больных с онкологическими, инфекционными и аутоиммунными заболеваниями позволят уточнить роль этих клеток в патогенезе заболевания, а также послужит основанием для оценки возможности применения ДК в качестве клеточных вакцин. Изучение эффективности разных способов доставки антигенного материала для стимуляции противоопухолевого материала позволит выбрать оптимальную тактику для проведения клеточной иммунотерапии. Клиническая апробация вакцин на основе ДК позволит оценить безопасность, охарактеризовать иммунокорригирующий эффект и клиническую эффективность предложенного варианта клеточной специфической иммунотерапии. Изучение хемокин-рецепторных взаимодействий, определяющих миграцию ДК и Т-лимфоцитов в лимфатические узлы и зону опухолевого роста, позволит обосновать выбор наиболее оптимального типа ДК для терапии больных с онкопатологией и вирусными инфекциями и оценить их переносимость/клинический эффект в пилотных исследованиях. Разработанные способы иммунокорригирующей терапии в модели ревматоидного артрита, индуцированного ДК, позволит изучить механизмы ДК-опосредованных аутоиммунных нарушений и изучить экспериментальные модели, которые будут в наибольшей степени отражать иммунный механизм нарушения естественной толерогенности в организме. Изучение Т-клеток памяти, стимулирующих тканевую регенерацию откроют новые возможности усиления регенеративной клеточной активности при лечении разных заболеваний, в том числе тех, лечение которых стандартными методами, является малоэффективным. Т-клетки памяти способны индуцировать антиидиотипические клеточные и гуморальные реакции. Это дает возможность использовать эти клетки в качестве вакцин при лечении аутоиммунных и аллергических заболеваний. Такая Т-клеточная вакцинация может найти широкое применение при лечении аутоиммунных заболеваний с неизвестной антигенной этиологией (например, болезнь Бехтерева), а также при лечении полиантигенных аллергических заболеваний. Возможность наращивания in vitro и использования Т-клеток памяти при проведении адаптивной Т-клеточной терапии может кардинально усилить эффективность опухоле-специфической иммунотерапии. Важно, что эти клетки могут быть выведены из под удара химиопрепаратов и использованы тогда, когда их ожидаемый эффект может быть максимальным.

Взаимодействие с другими НИУ, вузами, клиниками:

ИХБиФМ СО РАН, ГНЦ «Вектор», ФГУ НИИТО Минздравсоцразвития, ИЦиГ СО РАН

Смета: 120 млн. руб.

Область применения: иммунология, онкология, инфекционные заболевания, аутоиммунные заболевания аллергические заболевания, неврология

Форма внедрения:

Патенты, методические рекомендации, клинические испытания, новая медицинская технология.

Медико-социальная и экономическая эффективность:

Повышение эффективности лечения онкологических и инфекционных заболеваний, создание патогенетически обоснованных способов иммунокорригирующей терапии ревматоидного артрита.

Научно-медицинская литература

1. Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. // Nature. 1998; 392: 245-252.
2. Schuler G., Schuler-Thurner B., Steinman R.M. The use of dendritic cells in cancer immunotherapy. Curr. Opin. Immunol. 2003; 15: 138-147
3. Khan S., Greenberg J.D., Bhardwaj N. Dendritic cells as targets for therapy in rheumatoid arthritis. // Nat Rev Rheumatol. 2009 Oct;5(10):566-71.
4. Dunn G.P., Bruce A.T., Ikeda H., Old L.J., Schreiber R.D. Cancer immunoediting from immunosurveillance to tumor escape. // Nat. Immunol. 2002; 3: 991-998.
5. Kvistborg P., Boegh M., Pedersen A.W., Claesson M.H., Zocca M.B. Fast generation of dendritic cells. //Cell Immunol. 2009;260(1):56-62.
6. Carbonneil C., Saidi H., Donkova-Petrini V., Weiss L. Dendritic cells generated in the presence of interferon-alpha stimulate allogeneic CD4+ T-cell proliferation: modulation by autocrine IL-10, enhanced T-cell apoptosis and T regulatory type 1 cells. // Int Immunol. 2004 Jul;16(7):1037-52.
7. Klebanoff C.A., Gattinoni L., Restifo N.P. CD8+ T-cell memory in tumor immunology and immunotherapy.//Immunol Rev. 2006 Jun;211:214-24.
8. Page A.J., Ford M.L., Kirk A.D. Memory T-cell-specific therapeutics in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. // 2009 Dec;14(6):643-9.
9. Xiang R., Lode H.N., Gillies S.D., Reisfeld R.A.T cell memory against colon carcinoma is long-lived in the absence of antigen. // J Immunol. 1999 Oct 1;163(7):3676-83.
10. Leung B.P., Conacher M., Hunter D., McInnes I.B., Liew F.Y., Brewer J.M. A novel dendritic cell-induced model of erosive inflammatory arthritis: distinct roles for dendritic cells in T cell activation and induction of local inflammation. // The Journal of Immunology.- 2002.- Vol.169.- P.7071-7077.