Микроорганизмов к антибиотикам

Определение чувствительности микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП) - приобретает все более важное значение в связи с появлением и широким распространением антибиотикорезистентности у бактерий.Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП (диско-диффузионный и серийных разведений) были разработаны во второй половине 60-х - начале 70-х годов XX века и с тех пор с методической точки зрения не претерпели принципиальных изменений. Однако внедрение в клиническую практику значительного количества новых АБП и появление новых механизмов антибиотико-резистентности у микроорганизмов потребовало более строгой стандартизации процедуры тестирования, разработки новых подходов к интерпретации результатов, внедрения современной системы внутреннего контроля качества на каждом этапе исследования.В настоящем учебном пособии систематизированы современные подходы к определению чувствительности бактериальных возбудителей инфекционных заболеваний человека, учитывающие рекомендации Европейского комитета по определению чувствительности к антибиотикам, а также Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам США.Исследования чувствительности микроорганизмов к АБП осуществляются для решения следующих задач:- обоснования целенаправленной индивидуальной антибактериальной терапии для лечения конкретной инфекционной болезни; - обоснования эмпирической терапии отдельных нозологических форм инфекционных болезней в пределах лечебных учреждений или географических регионов;- осуществления наблюдения за распространением антибиотико-резистентности в отдельных учреждениях или географических регионах;- исследования новых химических соединений на наличие антибактериальной активности. Показания для исследования чувствительностимикроорганизмов к антибактериальным препаратам В ходе повседневной деятельности в бактериологических лабораториях из различных биологических материалов и объектов внешней среды выделяют множество бактерий, относящихся к различным таксономическим группам. Однако определение чувствительности выделенных микроорганизмов к АБП показано далеко не во всех случаях. Определение показаний для исследования чувствительности микроорганизмов к АБП является обязанностью врача-бактериолога.Обязательному исследованию на чувствительность к АБП подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека. В остальных случаях оценке чувствительности должна предшествовать оценка клинической значимости выделенного микроорганизма. Определение чувствительности выделенного штамма микроорганизма показано, если уровень его устойчивости к АБП не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма. Практически важной задачей является выявление приобретенной резистентности к АБП у природно - чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение природной чувствительности или резистентности микроорганизма к АБП не является целью практических исследований.Исследованию по оценке антибиотикочувствительности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева образца клинического материала, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.Прямое определение чувствительности с использованием клинического материала (без выделения чистой культуры) возможно только в исключительных случаях при условии подтверждения однородности культуры и высокой степени обсемененности при окраске по Граму, причем исследование следует повторить после выделения чистой культуры микроорганизма.Следует уделять особое внимание определению чувствительности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной резистентности.У микроорганизмов, проявляющих универсальную чувствительность к каким-либо АБП, т.е. когда случаи резистентности не описаны (например, Streptococcus pyogenes - все штаммы чувствительны к пенициллину), проводить определение чувствительности к этим препаратам в повседневной практике нецелесообразно.Факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе, следует оценивать крайне осторожно и рекомендуется обращаться за консультациями в лаборатории, изучающими антибиотикорезистентность.Не следует в практических целях исследовать микроорганизмы, для которых методы определения чувствительности в настоящее время не стандартизированы и отсутствуют критерии интерпретации результатов. Результаты, полученные в данном случае, не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению. Методы определения чувствительностимикроорганизмов к антибактериальным препаратам Общая характеристика методовСовременные стандартизированные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диффузионные.

Методы серийных разведений основаны на прямом определении основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП – величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК). При определении антибактериальной активности препарата определяют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) – это наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост исследуемых микроорганизмов и минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) – это наименьшая концентрация препарата, вызывающая бактерицидный эффект исследуемых микроорганизмов.

Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК. Этот принцип исследования широко используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК.В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.В диско-диффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или устойчивый).Е-тест представляет собой узкую полоску полимера (0,5x6,0 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных). Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП на каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю) поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.Оценка антибиотикочувствительности, независимо от конкретного метода, предполагает последовательное выполнение нескольких этапов:­ приготовление питательных сред;­ приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулюма);­ инокуляция;­ инкубация;­ учет и интерпретация результатов, формулировка рекомендаций по лечению. Диффузионные методы включают также этап наложения дисков или полосок Е-теста на плотную питательную среду.Для оценки чувствительности используют специально предназначенные для этой цели среды, разрешенные к применению и по своим характеристикам удовлетворяющие определенным требованиям. Внутрилабораторный контроль качества среды проводят при использовании всех сред разрешенных к применению в установленном порядке.Вид питательной среды для оценки чувствительности определяют выбранным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тестируемого микроорганизма.Выбранную питательную среду для определения чувствительности готовят из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри или (если необходимо) колбы со средой помещают в водяную баню при 48-50⁰С, где выдерживают до достижения указанной температуры, после чего в них асептически вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.Агар разливают по чашкам слоем толщиной 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм -20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительно использовать немедленно. Допускается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4 – 8⁰С в течение 5 суток. Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов(инокулюма)Общим и принципиально важным для всех методов тестирования является стандартизация суспензии исследуемого микроорганизма, ее концентрация должна составлять 1,5 x 10⁸ КОЕ/мл. Практически наиболее приемлемым методом оценки концентрации бактериальной суспензии является измерение её оптической плотности. Оптическая плотность бактериальной суспензии с концентрацией 1,5 x 10⁸ КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду. Контроль оптической плотности суспензии можно также осуществлять спектрофотометрически (денситометрически). Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры. Бактериальную суспензию можно готовить из бульонной или из агаровой культуры. Для приготовления инокулюма используют чистую суточную культуру микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах. Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначительное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность инокулюма точно до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда.Инокулюм следует использовать в течение 15 минут после приготовления. При определении чувствительности быстро растущих бактерий с обычными питательными потребностями для приготовления инокулюма также можно использовать 5 - 6 - часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 4,0 - 5,0 мл жидкой неселективной питательной средой, инкубируют при 35⁰С. Через 5 - 6 ч инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по Мак-Фарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.Стандарт Мак-Фарланда может быть либо приобретен, либо приготовлен в лаборатории. Методы серийных разведений

Этот метод может быть использован в двух модификациях – на жидкой и плотной питательной среде. Он является точным количественным методом, его применяют в научной работе и в особо важных случаях в лабораториях больниц.