Объяснение содержания лабораторной работы и формы отчетности. Преподаватель напоминает, что фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз

Преподаватель напоминает, что фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в эритроцитах и печени. Биологическая роль каталазы заключается в разложении вредной для организма перекиси водорода, образующейся при окислении некоторых веществ, на кислород и водород.

Уровень каталазы может служить показателем уровня активности антиоксидантной ферментной системы организма и иметь диагностическое значение. Преподаватель обращает внимание на особенности определения активности каталазы по Баху и Зубкову, поясняет как рассчитывается активность каталазы с помощью каталазного числа и показателя каталазы.

Работа по количественному определению каталазы крови может проходить в форме УИРС и использоваться для привития студентам навыков научно – исследовательской работы в плане исследовательской работы кафедры.

Для обнаружения дегидрогеназ лимоннокислого цикла используется мышечная ткань животных. Для выполнения работы студенты группируются по два человека. Протоколы оформляются в виде ниже представленных таблиц.

Самостоятельная работа студентов.

Студенты под руководством преподавателя декапитируют животных, проводят забор крови, извлекают мышечную ткань. При выполнении лабораторной работы студенты в качестве ориентировочной основы действия пользуются приводимыми в пракитикуме и методических указаниях описаниями лабораторных работ и пояснениями преподавателя. В процессе выполнения студентами лабораторных работ преподаватель контролирует и корректирует их действия для того, чтобы научить их необходимым практическим навыкам и умениям (см. рабочую тетрадь для студентов 2-го курса).

Контроль усвоения материала занятия.

Контроль усвоения материала занятия проводится в форме индивидуальной беседы в процессе проверки протоколов. Для проведения контроля рекомендуется использовать следующие вопросы.

1. Какой принцип положен в основу количественного определения каталазы по методу Баха и Зубковой?

2. Как выражается активность каталазы, что обозначает каталазное число?

3. Каково клинико – диагностическое значение определения каталазы крови?

4. К какому классу ферментов относится каталаза ?

5. Какую роль выполняет фермент каталаза при перекисном окислении липидов мембран ?

6. Каким способом можно обнаружить действие дегидрогеназ лимоннокислого цикла ?

7. Как проводится расчет активности каталазы?

8. Какие дегидрогеназы Вы обнаруживали в мышечной ткани?

9. Каким образом Вы доказали присутствие в мышцах сукцинатдегидрогеназы?

10. Каким образом Вы доказали наличие в мышцах изоцитратдегидрогеназы?

11. Для чего необходимо создать анаэробные условия в опыте по обнаружению дегидрогеназ?

12. Объясните почему в пробирках с добавлением цитрата и сукцината обесцвечивается метиленовый синий?

13. Почему в контрольной пробирке не наблюдается обесцвечивания метиленового синего?

Критерии достижения цели занятия.

1. Правильные ответы на поставленные вопросы.

2. Умение определить активность каталазы крови.

3. Умение обнаружить действие дегидрогеназ лиминнокислого цикла.

4. Правильно провести расчеты, сделать выводы и оформить протокол.

Таблица 1. Количественное определения каталазы крови. Принцип:основан на определении количества Н₂О₂, разложенной каталазой за определенное время, выявляемое по разности количества КМnО₄ израсходованного на титрование до и после действия каталазы.	Расчет	Каталазное число (КЧ)= (А-В) *1,7 = ? мг	Вывод: ? В норме каталазное число = 10-15. Таблица 2. Обнаружение дегидрогеназ цикла Кребса. Принцип:основан на восстановлении метиленовой сини в лейкоформу атомами водорода, передаваемыми дегидрогеназами с субстратов – изоцитрата и сукцината.	Окрашивание раствора	?	?	?	Вывод:дегидрогеназы цикла Кребса можно обнаружить с помощью восстановления метиленовой сини.
Количество 0,1 М р-ра КмпО₄в мл пошедшего на титров.	В= ?	А= ?
H₂SO₄ 10 %р-р	5 мл	-	Инкубация при 37°С	30 мин.	30 мин.	30 мин.
Н₂О₂ 1%р-р	-	2мл	Вазелиновое масло	10 кап.	10 кап.	10 кап.
Экспозиция	30 мин При комнт. темпер.	0,002%р-р метиленовой сини	10 кап.	10 кап.	10 кап.
H₂SO₄_, 10 % р-р	-	5 мл	20 % р-р сульфосали-циловой кислоты	-	-	10 кап.
Н₂О₂ 1%р-р	2мл	-	3%р-р сукцината натрия	-	10 кап.	-
Дист вода	7мл	7мл	3% р-р цитрата натрия	10 кап.	-	-
Разведен-ная кровь 1:1000	1мл	1мл	Мышечная ткань	На конце шпателя	На конце шпателя	На конце шпателя
Пробы (в стакан-чиках)	Опыт	Контроль	№ пробы	№1	№2	№3

ЗАНЯТИЕ №14

ТЕМА: Биологическое окисление. Исследование действия полифенолоксидазы. Определение активности пероксидазы.

Работа на занятии.

Цели занятия.

Студенты должны уметь:

- определить количественно активность пероксидазы в продажном препарате или растительном материале (капусте);

- объяснить значение измерения активности пероксидазы для контроля качества ферментного препарата;

- использовать ФЭК для определения плотности исследуемого раствора;

- обнаружить действие полифенолоксидазы картофеля по изменению окраски продуктов окисления адреналина;

- проанализировать результаты определений, оформить протокол и сформулировать выводы.

Цели самоподготовки.

Студенты должны знать:

- характеристику пиридин – и флавинзависимых дегидрогеназ, цитохромов;

- схему окисления субстратов с участием пиридинпротеинов, флавопротеинов, каталазы, пероксидазы, цитохромов;

- особенности главного и побочных путей биологического окисления субстратов;

- состав и функционирование дыхательной цепи митохондрий;

- характеристику окислительного, субстратного и фотосинтетического фосфорилирования и их роль в метаболизме;

- механизм окислительного фосфорилирования с точки зрения хемиосмотической гипотезы Митчела;

- строение митохондрий и их роль в организме;

- реакции глицерофосфатного и малатного челночных механизмов переноса атомов водорода через митохондриальную мембрану и их роль в процессе биологического окисления;

- характеристику свободно-радикального окисления;

- антиоксидантные системы организма;

- использование антиоксидантов в медицине, антиоксидантные препараты.

Хронокарта занятия.

Этапы занятия	Время (мин.)	Дидактическая система
1. Организационные вопросы	2 мин	Классическая
2.Контроль исходного уровня знаний студентов и его коррекция	28 мин.	Репетитор (хороший)
3. Организация самостоятельной работы студентов	10 мин.	Технические средства общегрупповые
4. Самостоятельная работа студентов	80 мин.	«Малая группа»
5. Итоговый контроль усвоения материала занятия	15 мин.	Репетитор (хороший)

Оснащение занятия.

1.Оборудование: ФЭК, весы аптечные с разновесами, ступки с пестиками, колба на 25 мл, пипетки на 1, 5 и 10 мл, штатив с пробирками, воронки, бумажные фильтры (или марля, вата), водяная или песочная баня, термостат (37°С), секундомер.

2. Реактивы:ацетатный буфер, 0,1 М раствор рН 5,4; пероксид водорода, 0,03% раствор; бензидин, 0,92 г/л, раствор на ацетатном буфере; адреналин, 0,1% раствор.

3. Материалы для исследования: клубни кортофеля, капустные листья.

Организационные вопросы.

Преподаватель выясняет, есть ли отсутствующие, обращает внимание на форму одежды студентов, сообщает цели занятия.

Контроль исходного уровня знаний.

Контроль проводится в виде устного разбора вопросов темы с последующим письменным контролем с помощью билетов исходного контроля знаний студентов (см. Методические рекомендации для самоконтроля знаний; «Введение в обмен веществ и энергии. Биохимия питания и пищеварения. Биологическое окисление. Обмен углеводов», 2013 г.). Оценки выставляются в кафедральном журнале.

Вопросы для обсуждения.

1. Характеристика пиридин – и флавинзависимых дегидрогеназ, цитохромов.

2. Главный и побочные пути биологического окисления.

3. Дыхательная митохондриальная цепь (компоненты и функционирование).

4. Окислительное фосфорилирование (хемиосмотическая гепотеза).

5. Строение митохондрий.

6. Глицерофосфатный и малатный челночные механизмы.

7. Свободно – радикальное окисление, реактивные интермедиаты кислорода.

8. Антиоксидантные системы организма.

9. Антиоксиданты в медицине.