Объяснение содержания лабораторной работы.
Преподаватель обращает внимание студентов на необходимость усвоения методов качественных реакций и количественного определения аминокислот и белков для проведения реакций идентификации аминокислотных фармакопейный препаратов и количественного анализа препаратов белковой природы. Указывает что свободные амино – и карбоксильные группы и радикалы аминокислот способны к разнообразным взаимодействиям. Некоторые из этих реакций приводят к образованию окрашенных продуктов, что используется для идентификации и количественного определения индивидуальных аминокислот. Для проведения качественных цветных реакций следует использовать растворы двух белков – яичного и желатина и отмечать присутствие выявляемых группировок и аминокислот в каждом белке. Желатин почти не содержит ароматических и серусодержащих аминокислот.
Реакции биуретовая и нингидриновая являются реакциями универсальными для природных белков, но не являются реакциями специфическими на белки. Реакция Фоля выявляет серусодержащие аминокислоты со слабосвязанной серой (цистин, цистеин). Метионин эту реакцию не дает, так как сера связана прочно. При выполнении биуретовой реакции нельзя добавлять избыток сернокислой меди, т.к. синий осадок гидрата оксида меди маскирует фиолетовое окрашивание биуретового комплекса. Аналогично при постановки реакции Миллона следует избегать передозировку реактива Миллона.
Биохимические методы легли в основу качественных реакций, используемых в фарманализе для выявления подлинности фармакопейных аминокислотных и белковых препаратов. Реакии на подлинность кислоты глутаминовой и желатина медицинского выполняют двое студентов и демонстрируют студенческой группе.
Цветные реакции выполняются студентами индивидуально.
Протокол оформляется в виде нижеприведенной таблицы, в которой указывается название реакции, исследуемый материал, используемые реактивы, окрашивание и принцип реакции.
Самостоятельная работа студентов.
Студенты самостоятельно выполняют цветные реакции на белки и аминокислоты, используя в качестве ориентировочной основы действия приводимое в практикуме описание лабораторных работ. Студенты показывают результаты реакций в пробирках преподавателю и оформляют протокол. В процессе выполнения студентами лабораторной работы преподаватель контролирует и корректирует работу студентов, чтобы научить их необходимым практическим навыкам.
Итоговый контроль усвоения материала занятия.
Контроль усвоения материала может быть проведен в форме индивидуальной беседы в процессе проверки протоколов. Для проведения контроля рекомендуется использовать следующие вопросы.
1. Почему биуретовая и нингидриновая реакции являются универсальными для всех белков?
2. Какими цветными реакциями можно обнаружить циклические аминокислоты в белке?
3. Укажите, с помощью каких реакций можно обнаружить в белке серусодержащие аминокислоты?
4. Какие цветные реакции используются для определения подлинности фармакопейных препарато: кислоты глутаминовой и желатина медицинского?
5. Как может быть использован в практической деятельности провизора навык выполнения цветных реакций на аминокислоты и белки?
6. Какая реакция используется для обнаружения a-NH2- группы?
7. Как называется проба для обнаружения тирозина? Какое при этом образуется окрашивание?
8. Какой материал из исследуемых Вами на занятии дает положительную биуретовую реакцию и почему?
9. Как проводится ксантопротеиновая реакция? Для чего она используется? Какое образуется при этом окрашивание?
10. Какая из перечисленных аминокислот (глицин, тирозин, фенилаланин) дает положительную реакцию с концентрированной азотной кислотой при нагревании?
11. Какой реактив используется для проведения реакции Фоля? Для чего она используется? Какое при этом образуется окрашивание?
12. При помощи, какой реакции обнаруживается наличие пептидной связи? Какое окрашивание при этом образуется?
13. Какая реакция используется для выявления a-амино группы? Какое при этом образуется окрашивание?
14. Какие соединения окрашиваются в фиолетовый цвет при проведении биуретовой реакции?
15. Перечислите вещества которые были использованы на занятии, дающие положительную нингидриновую реакцию.
Критерии достижения цели занятия.
1. Правильные ответы на поставленные вопросы.
2. Умение поставить цветные реакции на наличие белка и аминокислот.
3. Правильное оформление протоколов и правильно сформулированные выводы
Таблица 1
Цветные реакции на функциональные группы белков и аминокислот.
| Название реакции и выявляемая группа | Исследуемый материал | Употребляемые реактивы | Наблюдаемое окрашивание | Принцип реакции |
| 1. Биуретовая реакция на наличие пептидной связи | а) яичный белок, р-р, 5 капель б) глицилглицин, 1% р-р, 5 капель | биуретовый реактив, 2 капли | Фиолетовое Нет | Образование комплексного соединения |
| 2. Нингидриновая реакция на a - аминогруппу | а) яичный белок, р-р, 5 капель б) β-аланин, 1% р-р, 5 капель в) a-аланин, 1% р-р, 5 капель | 0,5% р-р нингидрина нагреть до кипения | Синее Нет Синее | Образование окрашенного комплекса |
| 3. Ксантопротеиновая реакция на ароматическое кольцо в аминокислоте | а) яичный белок, р-р, 5 капель б) тирозин, 1% р-р, 5 капель в) глицин, 1% р-р, 5 капель г) фенилаланин, 0,1% р-р, 5 капель | конц. НNО3, 3 капли нагреть до кипения добавление NаОН до оранжевого окрашивания | Желтое Желтое Нет Желтое | Образование динитропро-изводного соединения. Переход в хиноидные структуры |
| 4. Реакция Миллона на тирозин | а) яичный белок, р-р, 5 капель б) тирозин, 0,1% р-р, 5 капель в) глицин, 1% р-р, 5 капель | реактив Миллона, 5 капель нагреть до 50ºС | Красное Красное нет | Образование ртутной соли нитротирозина |
| 5. Реакция Фоля на аминокислоты содержащие слабосвязан-ную серу | а) яичный белок, р-р, 5 капель б) цистеин, 1% р-р, 5 капель в) глицин, 1% р-р, 5 капель | 5% р-р ацетата свинца, 10 капель, 20% р-р NаОН по каплям до растворения осадка и нагреть до кипения | Бурое Бурое Нет | Образование черно-бурого осадка плюмбита серы (сульфита свинца) |
| 6. Нитропруссидная реакция на серусо-держащие аминокислоты | а) неразб. яичный белок, 5 капель б) метионин, 0,1% р-р, 5 капель в) глицин, 1% р-р, 5 капель | 20% р-р NаОН, 10 капель кипятить 3 минуты, охладить! 5% р-р нитропруссида натрия, 3 капли | Красно-фиолетовое Красно-фиолетовое Нет | Образование комплексного соединения |
ВЫВОД: с помощью цветных реакций можно обнаружить присутствие белка и аминокислот в среде и в лечебных средствах.
ЗАНЯТИЕ №3
ТЕМА: Физико-химические свойства и структура белков. Диализ белков. Исследования денатурации белков. Хроматография аминокислот.
Работа на занятии.
Цели занятия.
Студенты должны уметь:
- разделить смесь аминокислот с помощью метода бумажной (восходящей) хроматографии;
- рассчитать Rf для каждой аминокислоты;
- очистить солевой раствор белка от низкомолекулярных примесей с помощью диализа;
- поставить химические реакции , используемые для денатурации белка;
- очистить белковый фарм. препарат от низкомолекулярных примесей;
- проанализировать результаты определений, сформулировать выводы, оформить протокол.
Цели самоподготовки.
Студенты должны знать:
- уровни структурной организации белков и связи их стабилизирующие;
- классификацию простых белков и характеристику отдельных их групп;
- физико-химические свойства белков;
- явление денатурации белков, факторы денатурации.
Хронокарта занятия
| Этапы занятия | Время | Дидактическая система |
| 1. Организационные вопросы | 2 мин | Классическая |
| 2. Контроль исходного уровня знаний студентов и его коррекция | 28 мин | Репетитор (хороший) |
| 3. Организация самостоятельной работы студентов. | 10мин | Технические средства общегрупповые |
| 4.Самостоятельная работа студентов | 80 мин | “Малая группа” |
| 5. Итоговый контроль усвоения материала занятия | 15 мин | Репетитор (хороший) |
Оснащение занятия.
1. Оборудование: термостат (37-38ºС), сушильный шкаф (100-105ºС), простые пробирки, пробирки длиной 18-20 см. диаметром 2,0-2,5 см с пробками, штатив, простой карандаш и линейка, чашки Петри, пинцет, ножницы, пипетки, водяная баня,диализатор, стеклянные палочки.
2. Реактивы:фенол, насыщенный водой; нингидрин, 0,2% р-р в ацетоне; сульфат аммония, насыщенный раствор; хлорид бария, 5% раствор; биуретовый реактив; азотная кислота, конц.; трихлоруксусная кислота, 10% раствор; сульфат меди, 5% раствор.
3. Материалы для исследования:раствор смеси аланина, лейцина и глутаминовой кислоты, 0,04 моль/л; раствор яичного белка.
4. Таблицы: «Уровни структурной организации белка», «Денатурация белков».
Организационные вопросы.
Преподаватель выясняет, есть ли отсутствующие, обращает внимание на форму одежды студентов, сообщает цели занятия, интересуется посещаемостью лекций.
Контроль исходного уровня знаний студентов.
Контроль проводится в виде устного разбора материала темы с последующим письменным контролем с помощью билетов исходного уровня знаний (см. мет. рекомендации для самоконтроля знаний студентов 2-го курса по теме «Простые и сложные белки. структура и функции. Ферменты и витамины как их кофакторы. Строение, свойства, механизм действия, номенклатура и классификация ферментов» - 2013 г.).
Вопросы для устного опроса.
1. Структурная организация белковых молекул.
2. Химические связи, стабилизирующие первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуру белка.
3. Классификация простых белков с характеристикой их отдельных групп.
4. Физико-химические свойства белков.
5. Денатурация белков.