Опыт 2. Разделение и изучение химических свойств пигментов зеленого листа
Опыт 1. Приготовление вытяжки пигментов
Пигменты лучше всего экстрагировать из свежего материала, но можно также использовать и сухие листья. В последнем случае надежным способом фиксации служит замораживание тканей с последующей лиофилизацией (лиофильной сушкой). Недопустимо фиксирование растительного материала сухим жаром в сушильном шкафу, поскольку постепенное увеличение температуры сопровождается усилением гидролитических процессов. Извлечение пигментов и дальнейшие исследования их свойств необходимо проводить в затененном помещении для уменьшения интенсивности процесса фотоокисления. Для анализа берут растительный материал из зеленых свежих или сухих листьев. Для улучшения извлечения пигментов сухой материал перед проведением опыта ошпаривают кипятком. В зависимости от целей эксперимента измельчению подвергают весь лист полностью или лист, освобожденный от главной жилки.
Навеску исследуемого материала массой 2 г, взвешенную на аналитических весах с точностью до 0,001, г тщательно измельчают в фарфоровой ступке с кварцевым песком и небольшим количеством мела или углекислого магния. (Использование слаборастворимых карбонатов связано с необходимостью нейтрализации кислот, в присутствии которых возможен процесс феофитинизации хлорофиллов и изменение их окраски). Для экстрагирования пигментов к измельченному материалу добавляют 10 см3 100%-ного ацетона или этанола с крепостью 96-98о и тщательно перемешивают. Полученную суспензию переносят на стеклянный фильтр № 2 или № 3, смонтированный в пробке колбы Бунзена. (Во избежание потерь край ступки с внешней стороны смазывают вазелином, а суспензию сливают по стеклянной палочке). Вытяжку отфильтровывают под разряжением. К остатку в ступке добавляют немного растворителя, снова растирают и отфильтровывают. Процедуру повторяют несколько раз до полного извлечения пигментов. (В этом случае стекающий в колбу Бунзена растворитель будет бесцветным). Полученную вытяжку переносят в мерную колбу на 50 см3. Колбу Бунзена ополаскивают небольшим количеством чистого растворителя, который затем приливают к основной вытяжке. Раствор в колбе доводят до метки и перемешивают. Хранят его в темном прохладном месте. Вытяжка содержит хлорофиллы, каротины и ксантофиллы и может быть использована для выполнения дальнейших экспериментов.
Опыт 2. Разделение и изучение химических свойств пигментов зеленого листа
2.1 Разделение пигментов по Краусу
Метод основан на различной растворимости пигментов в органических растворителях.
В пробирку наливают 3-4 см3 спиртовой вытяжки пигментов, прибавляют
6-8 см3 петролейного эфира (бензина или гексана) и 2-3 капли воды во избежание образования эмульсии. Пробирку закрывают пробкой и несколько раз сильно встряхивают, а затем дают 2 минуты постоять. При этом происходит разделение слоев, относительное положение которых определяется значением их плотностей. Хлорофиллы и каротин лучше растворяются в неполярном растворителе по сравнению с разбавленным водой спиртом. Водно-спиртовой слой содержит ксантофиллы. Если разделение пигментов будет недостаточно полным (оба слоя окрашены в зеленый цвет), то следует добавить в пробирку еще 1-2 капли воды и снова взболтать. Помутнение нижнего слоя (от избытка воды) можно устранить, добавив немного спирта. Разделение проводят параллельно в нескольких пробирках, которые сохраняют для выполнения последующих опытов. Наблюдаемые результаты заносят в таблицу 1.1.
2.2 Омыление хлорофилла щелочью и отделение каротина
В пробирку, полученную в опыте 2.1, прибавляют небольшое количество (0,2-0,5 г) NaOH или KOH, закрывают пробкой, тщательно перемешивают и оставляют отстояться. В результате омыления хлорофиллы приобретают более гидрофильные свойства и, соответственно, перераспределяются между полярным и неполярным растворителем. Результаты опыта заносят в таблицу 1.1.
Таблица 1.1
| Результаты опыта 2.1 | Результаты опыта 2.2 | |||
| верхний слой | нижний слой | верхний слой | нижний слой | |
| цвет | ||||
| предполагаемый состав пигментов |
В тетради дают объяснение протекающего при омылении процесса, приводящего к изменению физико-химических свойств хлорофилла.
2.3 Хроматографическое разделение пигментов
Для проведения опытов все пигменты из вытяжки переводят в неполярный растворитель (петролейный эфир, бензин или гексан). Для этого в делительную воронку вносят 20 см3 вытяжки, добавляют 15 см3 неполярного растворителяя; смесь перемешивают. Затем добавляют 30 см3 воды, воронку осторожно взбалтывают, избегая образования эмульсии. После окончания расслоения водную фазу сливают. Промывание водой повторяют 5-10 раз. (В ряде методов первые два промывания проводят насыщенным раствором NaCl). После удаления всех водорастворимых соединений экстракт переносят в сухую колбу и подсушивают путем добавления 2-3 г прокаленного сульфата натрия. Полученный экстракт отфильтровывают через стеклянный или бумажный фильтр в сухую мерную колбу объемом 25 см3 и доводят до метки используемым растворителем.
2.3.1 Разделение пигментов с помощью колоночной хроматографии по Цвету
Разделение проводят методом колоночной хроматографии. В узкой нижней части предварительно высушенной хроматографической колонки помещают ватный тампон. Затем в колонку небольшими порциями вносят сорбент (карбонат кальция или тонкомолотую сахарную пудру), который уплотняют постукиванием колонки о твердую поверхность.
Хроматографическую колонку плотно фиксируют в пробке колбы Бунзена. Для увеличения скорости разделения процесс проводят при создании разряжения с помощью вакуумного или водоструйного насоса. Сначала сорбент по всему объему смачивают петролейным эфиром (бензином или гексаном), затем вносят в колонку 5 см3 раствора пигментов в неполярном растворителе. После впитывания раствора в верхние слои адсорбента проводят первичное хроматографирование пигментов вытяжки путем приливания в колонку небольших объемов петролейного эфира (бензина или гексана). Процесс останавливают в тот момент, когда нижний слой пигментов окажется на высоте 2-3 см от нижнего края колонки. Если полного разделения пигментов не произошло (некоторые зоны пигментов перекрывают друг друга), колонку промывают небольшими порциями смеси петролейного эфира и бензола в соотношении 10:1. При этом происходит образование раздельных зон хлорофиллов a и b, ксантофиллов, а каротины полностью элюируются.
В тетради схематично зарисовывают распределение пигментов в хроматографической колонки по завершении разделения.
2.3.2 Разделение пигментов с помощью одномерной распределительной хроматографии на бумаге
Несмотря на существенное различие пигментов зеленых листьев растений (хлорофиллов, каротинов, ксантофиллов) по химическому строению и, соответственно, физическим свойствам, полного их разделения при однократном хроматографировании на бумаге достичь, как правило, не удается. Для выделения отдельных относительно чистых фракций можно использовать разделение с помощью нескольких систем подвижных фаз (элюентов). В частности, для разделения хлорофиллов a и b рекомендована смесь петролейного эфира или бензина с полярными растворителями (ацетоном или спиртом). При этих условиях удовлетворительное разделение желтых пигментов невозможно. Для этой цели применяют смесь неполярных растворителей – петролейного эфира или бензина с бензолом. В обоих случаях техники разделения схожи.
Предварительно в хроматографическую камеру для насыщения парами растворителей ее внутреннего объема устанавливают чашки Петри, заполненные элюентом с толщиной слоя около 1 см (для разделения хлорофиллов в качестве подвижной фазы используют смесь петролейный эфир-ацетон (10:1), для разделения каротинов и ксантофиллов – смесь петролейный эфир-бензол (1:2)). Хроматографическую камеру по возможности плотнее закрывают крышкой (для повышения герметичности допускается смазывание краев камеры вазелином).
На листе хроматографической бумаги размером 18*18 см на расстоянии 2 см от нижнего края простым карандашом проводят линию старта, на которую с помощью стеклянного капилляра, автоматического дозатора или шприца наносят раствор пигментов в петролейном эфире (бензине или гексане) (возможно нанесением в виде точек, расположенных на небольшом расстоянии друг от друга, или сплошной линии). Записывают израсходованный объем раствора. Затем бумагу подсушивают в потоке теплого воздуха. Указанную процедуру проводят несколько раз до получения небольших четких ярко окрашенных зон.
Хроматографическую бумагу сворачивают в виде цилиндра, скрепляя противоположные концы листа в нескольких местах с помощью канцелярских скрепок или скрепок для степлера, и устанавливают в чашки Петри в хроматографической камере для разгонки. Во избежание разрушения пигментов камеру закрывают черной бумагой или устанавливают в темное место. После того, как фронт элюента поднимется на высоту 12 см или выше и будет заметно четкое разделение пигментов, хроматограмму вынимают и высушивают.
Описывают четкость разделения отдельных фракций пигментов. Для каждой полосы рассчитывают значение Rf и полученные данные заносят в таблицу 1.2.
Таблица 1.2
| Состав элюента | Цвет полосы | Значение Rf | Вид пигмента |
Из полученных хроматограмм вырезают полоски, соответствующие отдельным индивидуальным пигментам (или группам пигментов), измельчают с помощью ножниц, помещают в стеклянные стаканчики для элюирования, приливают по 2-3 см3 растворителя (в случае хлорофиллов – ацетон, каротиноидов – петролейный эфир). Стаканчики встряхивают несколько раз и затем сливают раствор в сухие мерные колбы на 25 см3. Операцию повторяют до полного обесцвечивания фрагментов бумаги. Объем элюата в мензурке доводят используемым растворителем до 25 см3. Полученные растворы сохраняют для последующих опытов 3.2 и 4.2.