Объяснение содержания лабораторной работы и формы отчетности.
Преподаватель обращает внимание студентов на способ собирания слюны, как источника фермента – альфа-амилазы. В качестве исходной слюны берется слюна (без пены), разведенная в 5 раз. При проведении работы по определению зависимости скорости ферментативной реакции от температуры следует для инактивации фермента кипятить слюну не менее 5 минут, а для создания пониженной температуры использовать заранее замороженную в холодильнике воду. Все остальные реакции возможно проводить при комнатной температуре (20-22°С), а в случае пониженной температуры в помещении пользоваться термостатом (25-38°С). Все работы выполняются каждым студентом в соответствии с их описанием, приведенным в практикуме. Протокол оформляется в виде нижеприводимых таблиц (см. рабочую тетрадь для студентов 2-го курса).
Самостоятельная работа студентов.
Студенты выполняют работы индивидуально, используя в качестве ориентировочной основы действия приведенное в практикуме описание лабораторных работ и пояснения преподавателя. Студенты показывают преподавателю результаты реакций в пробирках и оформляют протокол. В процессе выполнения студентами лабораторных работ преподаватель контролирует и корректирует действия студентов, чтобы научить их необходимым практическим навыкам.
Итоговый контроль усвоения материала занятия.
Контроль усвоения материала может быть проведен в форме индивидуальной беседы со студентами в процессе проверки протоколов. Для проведения контроля рекомендуется использовать следующие вопросы.
1. Каким образом можно измерить активность a-амилазы?
2. Какие условия необходимо создать при определении активности ферментов?
3. Каким образом выявляются продукты расщепления крахмала?
4. Как можно определить стадию расщепления крахмала?
5. Покажите работу по изучению зависимости скорости ферментативной реакции от количества фермента. Объясните полученные результаты.
6. Покажите работу по изучению специфичности действия a-амилазы. Объясните полученные результаты.
7. Покажите работу по изучению влияния температуры на активность a-амилазы. Объясните полученные результаты.
8. Покажите работу по изучению действия активаторов и ингибиторов. Объясните полученные результаты.
9. Как зависит активность фермента от его количества? Как Вы это доказали?
10. Как зависит активность фермента от температуры? Как Вы это доказали?
11. Какое вещество является активатором a-амилазы? Ингибитором? Как Вы это доказали?
12. В каком случае расщепление крахмала идет более интенсивно: под влиянием НCl или a-амилазы? Как Вы это доказали?
13. Является ли сахароза субстратом a-амилазы? Как Вы это доказали?
14. Какие ферменты находятся в слюне? Какие вещества являются их субстратами? Как Вы это доказали?
15. Какая реакция используется для обнаружения глюкозы?
16. Какие продукты выявляет проба с крахмалом?
17. На какое соединение проводится проба Фелинга? Как она выполняется?
Критерии достижения цели занятия.
1. Правильные ответы на поставленные вопросы.
2. Умение выявить характерные свойства ферментов.
3. Правильное оформление протокола и умение сформулировать выводы.
| Таблица | Сравнительное действие альфа-амилазы и соляной кислоты на реакцию гидролиза крахмала. | Принцип: ? | Выявляемые продукты | Крахмал | Декстрины | Мальтоза | ВЫВОД: ферментативный гидролиз превосходит кислотный гидролиз крахмала |
| Проба с йодом | окрашивание | Синее | Фиолетовое | Желтое | |||
| метод | 5 капель гидролизата + 1-2 капли раствора йода | 5 капель гидролизата + 1-2 капли раствора йода | 5 капель гидролизата + 1-2 капли раствора йода | ||||
| Условия гидролиза | Водяная баня 38°С, 15 минут | Водяная баня 100°С, 15 минут | Водяная баня 38°С, 15 минут | ||||
| № пробирки и ее содержимое | №1 1мл воды+1мл 1% 1 раствора крахмала | №2 1мл 10% раствора HCl + 5мл 1% раствора крахмала | №3 1мл исходной альфа-амилазы + 5мл 1% раствора крахмала |
| Таблица | Свойства ферментов (зависимость скорости ферментативных реакций от количества ферментов, от температуры, от активаторов и ингибиторов, специфичности ферментов). | Выявляемые продукты | Ахродекст-рины | Эритродекст-рины | Крахмал | Крахмал | Эритродекст-рины | Крахмал | Мальтоза | Дисахариды | Эритродекст-рины | Ахродекст-рины | Крахмал | Вывод: Активность ферментов зависит от их количества, температуры, наличия активаторов и ингибиторов и специфичности. |
| Наблюдаемое окрашивание | Желтое | Красное | Синее | Синее | Красное | Синее | Красный осадок | Синее | Красное | Желтое | Синее | |||
| Дополнительные условия проведения реакций | 4мл 1%раствора крахмала, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 1 капля йода в иодиде калия | условия реакции те же | условия реакции те же | 10 капель 1% раствора крахмала, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 1 капля йода в иодиде калия | условия реакции те же | 10 капель 1% раствора крахмала, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 1 капля йода в иодиде калия | 10 капель 1% раствора крахмала, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 5 капель реактива Фелинга, нагреть до кипения | 10 капель 2% раствора сахарозы, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 5 капель реактива Фелинга, нагреть до кипения | 20 капель 0,5% раствора крахмала + 10 капель дистиллированной воды, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 1 капля йода в иодиде калия | 20 капель 0,5% раствора крахмала + 10 капель раствора NaCl, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 1 капля йода в иодиде калия | 20 капель 0,5% раствора крахмала + 10 капель CuSO4, экспозиция 10 минут при комнатной температуре + 1 капля йода в иодиде калия | |||
| Материал исследования | Амилаза, разведенная 1:10 – 1мл | Амилаза, разведенная 1:50 – 1мл | Амилаза, разведенная 1:100 – 1мл | Кипяченая исходная амилаза | Исходная амилаза – 5 капель | Исходная амилаза – 5 капель | Исходная амилаза – 5 капель | Исходная амилаза – 5 капель | Исходная амилаза – 5 капель | Исходная амилаза – 5 капель | Исходная амилаза – 5 капель |
ЗАНЯТИЕ № 10
ТЕМА: Механизм действия ферментов. Номенклатура и классификация ферментов. Количественное определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови унифицированным методом.
Работа на занятии.
Цели занятия.
Студенты должны уметь:
- количественно определять активность альфа-амилазы в сыворотке крови амилокластическим методом;
- использовать ФЭК для определения плотности исследуемых растворов;
- объяснить диагностическое значение активности альфа – амилазы крови;
- проанализировать результаты количественного определения альфа-амилазы в сыворотке крови, оформить протокол и сформулировать выводы.
Студенты должны знать:
- механизм действия ферментов;
- номенклатуру и классификацию ферментов;
- характеристику отдельных классов ферментов.
Хронокарта занятия.
| Этапы занятия | Время (мин.) | Дидактическая система |
| 1. Организационные вопросы | 2 мин | Классическая |
| 2.Контроль исходного уровня знаний студентов и его коррекция | 28 мин. | Репетитор (хороший) |
| 3. Организация самостоятельной работы студентов | 10 мин. | Технические средства общегрупповые |
| 4. Самостоятельная работа студентов | 80 мин. | «Малая группа» |
| 5. Итоговый контроль усвоения материала занятия | 15 мин. | Репетитор (хороший) |
Оснащение занятия.
1.Оборудование: водяная баня, термостат (37°С), штатив с пробирками, пипетки на 1мл, мерные колбы на 50мл, ФЭК.
2. Реактивы:крахмал, 20 г/л раствор; фосфатный буфер, 0,1М раствор с рН=7,2; натрия хлорид, 30 г/л раствор; соляная кислота, 1М раствор; йод, 0,1М раствор в 30 г/л раствора иодида калия.
3. Материалы для исследования: сыворотка крови.
Организационные вопросы.
Преподаватель выясняет, есть ли отсутствующие, обращает внимание на форму одежды студентов, сообщает цели занятия, интересуется посещаемостью лекций.
Контроль исходного уровня знаний.
Контроль проводится в виде устного опроса студентов с последующим письменным контролем с помощью билетов исходного контроля знаний студентов (см. Методические рекомендации для самоконтроля знаний: «Простые и сложные белки. структура и функции. Ферменты и витамины как их кофакторы. Строение, свойства, механизм действия, номенклатура и классификация ферментов», 2013 г.). Оценки выставляются в кафедральном журнале.
Вопросы для обсуждения.
1. Механизм действия ферментов. Теория Михаэлиса-Ментена
2. Номенклатура ферментов. Принципы, положенные в основу номенклатуры.
3. Классификация ферментов, на чем она основана, тривиальные и систематические названия ферментов.
4. Характеристика классов и основных подклассов оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз, лигаз.
5. Применение ферментов в медицине. Ферментотерапия и ферментодиагностика.