Изменения содержания объема общего кальция, неорганического фосфора и активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови при заболеваниях костной

Системы

При портальном циррозе печени повышенная активность ще­лочной фосфатазы сочетается с повышением содержания билиру­бина в крови.

При алиментарных остеодистрофиях важное диагностическое значение имеет определение индекса активности щелочной фос­фатазы в динамике (активность щелочной фосфатазы в мг% в 1 ч при 37 °С/неорганический фосфор сыворотки крови в мг%).

Для выражения активности щелочной фосфатазы предложено много величин (единицы активности Боданского, Кинга и Армст­ронга, Бесси, Лоури, Брока и др.). Между ними существует следу­ющая зависимость:

nВɛ = [0,5 + 0,4] • ВαВɛ; nВɛ = [2,1n - 0,7] • КАɛ;

nКАɛ = [0,48п + 0,4] • Вɛ; nКАɛ = [0,24 + 0,8] • ВαВɛ;

nВαВɛ = [4,2п - 2,5] • КАɛ; nВаВɛ = [2n - 0,8] • Вɛ,

где n — число подлежащих пересчету единиц.

Пересчет активности в международные единицы (µМол/мин/ 1000мл, 37 °С) можно произвести путем умножения Вɛна 5,35; КАɛ на 1,8 и ВαВɛ на 16,7.

При расчетах необходимо исходить из следующих соотноше­ний:αγ

Следует также отметить, что кроме гидролитической функции фосфатазы обладают также способностью переносить фосфатные остатки, т. е. функцией трансферазы. Донорами в таких реакциях служит ряд эфиров (фосфокреатин, глюкозо-1-фосфат, п-нитро-фенилфосфат и др.). Акцепторами остатков фосфорной кислоты могут быть простые спирты, глицерин, фруктоза, глюкоза и др. Однако в настоящее время недостаточно ясно, какое значение имеют реакции подобного типа и в какой степени они могут быть использованы в диагностическом отношении, так как реакции, катализируемые фосфатазами, являются равновесными, причем это равновесие так далеко смещено в направлении гидролиза, что маловероятно, чтобы эти реакции синтеза фосфатных эфиров имели значительное физиологическое значение.

Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови определя­ют по И. М. Белякову. Принцип метода основан на способности фермента отщеплять при рН 8,6 и температуре 37 °С неорганичес­кий фосфор от фосфорного эфира (3-глицерофосфата натрия. Оп­ределение активности щелочной фосфатазы заключается в уста­новлении разности между содержанием неорганического фосфора (с использованием аскорбинового редуцента) в сыворотке крови до и после инкубации с ᵦ-глицерофосфатом натрия. Активность фермента выражается в единицах Боданского. Одна единица соот­ветствует 1 мг фосфора, отщепляемого под действием фермента в течение 1 ч при температуре 37 °С.

Диастаза(α-амилаза). Определение ее активности в сыворотке крови нашло широкое применение при диагностике заболеваний поджелудочной железы. Патогномоничность этого теста сделала его ценным методом дифференциации особенно острых панкреа­титов от колик, связанных с желчно-каменной болезнью, язвами желудка и кишок, острой непроходимостью кишечника. При ост­ром панкреатите активность энзима возрастает в 10—30 раз по сравнению с исходным уровнем. При некротических панкреати­тах активность диастазы падает, так как пораженная некрозом поджелудочная железа теряет способность продуцировать энзим.

Уровень диастазы в крови понижается также при сахарном диа­бете, тяжелых ожогах, тиреотоксикозе, отравлении хлороформом, четыреххлористым углеродом, барбитуратами, после тяжелых операций. Повышается он при воспалениях слюнных желез, ост­ром и хроническом холецистите, токсических гепатитах, циррозе печени.

Одновременное определение активности диастазы в крови и моче оказалось важным для суждения о состоянии почечной фун­кции, так как нефрозы, гломерулонефриты, нефроциррозы и т. п. обычно сопровождаются увеличением активности этого энзима в крови, в то время как содержание его в моче резко снижается. Та­ким образом коэффициент активность амилазы крови/активность амилазы мочи может служить критерием функциональной полно­ценности почек.

Активность диастазы сыворотки крови определяют по методу Вольгемута. В тех пробирках, где крахмал не расщепился полнос­тью, жидкость остается окрашенной в синий цвет, а в пробирках, в которых крахмал под действием диастазы превратился в декст­рин, — окрашивается в фиолетовый или желтоватый цвет. Допус­тим, что содержимое шестой пробирки окрасилось в синий, а пя­той — в фиолетовый цвет. Тогда результат определяют по пятой пробирке, в которой, например, было разведение 1 : 32. Разведе­ние умножают: 32 : 2 = 64. Норма активности по этой методике около 32.

Альдолазакатализирует реакции расщепления промежуточного продукта окисления углеводов— 1,6-дифосфорного эфира фрук­тозы — на фосфотриозы. Фермент осаждается спиртом и ацето­ном, в высушенном состоянии длительно сохраняет свою актив­ность. Хорошо растворяется в воде и легко экстрагируется ею из ацетонового порошка. Альдолаза довольно стабильна, не разруша­ется в течение 10 мин при 50 °С и инактивируется при нагревании выше 60—70 °С.

Энзим относительно малочувствителен к небольшим измене­ниям рН среды. Оптимум его активности зависит от температуры, рН и наличия в среде ингибиторов и активаторов.

Для определения активности альдолазы в сыворотке крови существует несколько методов, основанных на различных прин­ципах.

Саблей и Лянингер разработали наиболее простой метод оп­ределения активности альдолазы, основанный на образовании 2,4-динитрофенилгидразинов фосфотриоз и колориметрическом измерении экстинкции раствора, образующейся при добавлении щелочи при светофильтре 540 нм. Интенсивность окраски про­порциональна концентрации фосфотриоз. Дауне, Барнет и Байер, а затем Брукс и сотр. усовершенствовали этот метод.

Повышение активности альдолазы отмечается при мышечных дистрофиях (некроз сердечной мышцы), декомпенсированныхпороках сердца, инфаркте, поражении печени при отравлении че­тыреххлористым углеродом (остром гепатите), механической жел­тухе.

В эритроцитах здоровых животных альдолазы в 70—80 раз больше, чем в сыворотке крови, поэтому гемолизированная кровь совершенно непригодна для анализа сыворотки на активность альдолазы.

Лизоцим(мурамидаза) в организме животных находится в кро­ви (сыворотка, плазма, лейкоциты, тромбоциты), слезах, слюне, выделениях из носа, бронхов, желудочном и кишечном соке, молоке, влагалищном секрете, сперме, экссудатах брюшной по­лости, плевры и в моче. Небольшие количества имеются в экск­ретах.

Лизоцим обладает выраженными бактериостатическими свой­ствами. К его действию весьма чувствительны Вас. micrococcus, staphylococcus, streptococcus, proteus, но резистентны грамотрицательные микробы. Лизоцим обладает сильным антибактериаль­ным действием на грамположительные микробы в среде, содержа­щей угольную кислоту (Н₂СО₃) и диоксид углерода (СО₂). В при­сутствии комплемента и специфических антител лизоцим дей­ствует также и на грамотрицательные микробы.

Предложено два метода определения активности лизоцима — бактериологический (биологический) и вискозиметрический. При первом методе (Флеминга) измеряется интенсивность уменьше­ния получения суспензии из Micrococcus lysodeicticus под влияни­ем лизоцима. Это весьма простой метод, однако менее точный, чем вискозиметрический, основанный на измерении снижения вязкости в полисахаридном субстрате. Единицей активности ли­зоцима считается количество препарата, которое в течение 10 мин снижает вязкость полисахаридного раствора наполовину. 0,73 у кристаллического лизоцима из яичного белка содержит одну еди­ницу активности лизоцима.

Карбоангидразакатализирует обратимую реакцию: СО₂ + Н₂О <-> Н₂СО₃ <-> Н⁺ + НСО₃-.

Карбоангидраза получена в кристаллическом виде из эритро­цитов. Энзим теряет активность после нагревания до 60—65 °С че­рез 30 мин. Это один из наиболее активных ферментов: одна его молекула может в течение 1 с произвести гидратацию 45 000 моле­кул диоксида углерода. Оптимум ее активности находится в преде­лах рН 5,0-9,0.

Основная функция карбоангидразы эритроцитов — стимуля­ция отдачи СО₂ в легких и ускорение приема СО₂ из тканей орга­низма в кровь. Особенно важную роль выполняет Карбоангидраза в почках при резорбции ионов натрия и поддержании щелочного резерва крови.

Образующийся при обменных процессах диоксид углерода пе­реводит энзим в угольную кислоту (Н₂СО₃), которая затем диссоциирует на Н⁺ и НСО₃-. В 10 мл крови животных содержится 14— 18ед. карбоангидразы (по Раутану и Мальдруму). После деления числа единиц карбоангидразы на показатель гематокрита получа­ется так называемый индекс карбоангидразы, который у здоровых особей составляет 0,32—0,39 и имеет весьма высокую стабиль­ность.

Активность карбоангидразы понижена при анемиях, однако индекс карбоангидразы при этом обычно повышен как показатель увеличения насыщенности эритроцитов энзимом по сравнению с нормой. Снижение карбоангидразной активности бывает при де-компенсированных пороках сердца, сопровождающихся общим цианозом, а также при желтухе.

Активность карбоангидразы крови определяют по методу Мальдрума и Раутана. Единица активности — количество фермен­та, сокращающее в стандартных условиях время реакции наполо­вину.

Рибонуклеазапредставляет собой термостабильный фермент, расщепляющий рибонуклеиновую кислоту (РНК). Она имеется в поджелудочной железе, панкреатическом соке, печени, селезенке, почках и полиморфноядерных лейкоцитах. Для ДНК она неактив­на. Температурный оптимум рибонуклеазы близок к 60 °С, а рН около 7,6 (активность сохраняется при рН от 5,0 до 6,0). Актива­тором энзима являются ионы магния. При 85 °С активность фер­мента исчезает, но после охлаждения полностью восстанавливает­ся. При лейкемиях содержание рибонуклеазы в моче повышается, а в сыворотке крови удерживается в пределах нормы. Повышение активности рибонуклеазы сыворотки крови выражено при уре­мии.

Активность рибонуклеазы сыворотки крови определяют по ме­тоду Куница, а также Фирса и Миллера.

Пептидазы(карбоксипептидаза, аминопептидаза, пролиназа и пролидаза) принадлежат к пептидазам, катализирующим гидролиз продуктов распада белков — полипептидов, под действием кото­рых они гидролизуются до аминокислот. Пептидазы вырабатыва­ются в слизистой оболочке тонких кишок и выделяются с кишеч­ным соком. В составе пептидаз обычно выделяют карбоксипепти-дазу, аминопептидазу, пролиназу и пролидазу, обладающие боль­шой специфичностью действия.

Повышение уровня пептидаз в крови отмечается при массив­ных поражениях тканей (обширные ожоги), лобарной пневмонии, переломах костей, раке и лейкемиях. Повышение их активности обычно имеет место при острых и подострых воспалениях печени, обтурационной желтухе, гломерулонефрите, что широко исполь­зуется при их диагностике. После обработки четыреххлористым углеродом отмечается закономерное повышение зеркала пептидаз в крови жвачных.

Определение активности карбоксипептидазы основано на способности ее освобождать карбоксильные группы, прирост содержания которых определяется титрометрически. Ход опре­деления: в две колбочки (проба и контроль) вносят по 1 мл пре­парата фермента и 10 мл буферного раствора с рН 8,0. Содержи­мое контроля нагревают до кипения. В обе колбочки вносят по 5 мл гидролизата эдестина и ставят в термостат при 37 °С на 1 ч, затем нагревают до кипения. В обе колбочки вносят по 0,5 мл 0,1%-ного раствора фенолфталеина и титруют до одинаково ро­зовой окраски 0,02 н. раствором натрия гидроксида (едкого на­трия).

За единицу активности карбоксипептидазы принимают актив­ность, при которой за 10 мин освобождается такое количество карбоксильных групп, которое соответствует 1 мл 0,02 н. раствора натрия гидроксида.

Определение активности аминопептидазы сыворотки крови методом Грина в модификации Гольдберга основано на колори­метрическом вычислении количества р-нафталамина, освобож­денного аминопептидазой из субстрата α-лейцин-β-нафтиламида.

Глютаматдегидрогеназа.Определение ее активности основано на том, что дегидрогеназа катализирует обратимую реакцию пре­вращения α-кетоглютаминовой кислоты в α-кетоглютаровую. На стадии α-кетоглютаровой кислоты в цикле трикарбоновых кислот возможен выход этой кетокислоты из цикла и превращение ее в α-глютаминовую кислоту посредством аминирования за счет сво­бодного аммиака или обратимой реакции переаминирования.

Фермент содержится прежде всего в печени, миокарде, почках. Содержание дегидрогеназы глютаминовой кислоты (глютаматдегидрогеназы) в лейкоцитах при лимфоидном и миелоидном лей­козах в 4—5 раз выше, чем у здоровых животных, но повышается при заболеваниях печени (гепатит, цирроз), отравлении четырех­хлористым углеродом.

Методика определения активности глютаматдегидрогеназы ос­нована на ее воздействии на глютаминовую кислоту при рН 7,6 и температуре 37 °С в присутствии никотинамидадениндинуклеотида. Увеличение экстинкции при 340 нм во время перехода оксиди­рованной формы кофермента в редуцированную является пропор­циональным концентрации фермента.

Фруктозо(кетозо)-1-фосфатальдолазасодержится в клетках пе­чени наряду с 1,6-дифосфатальдолазой (альдолазой) и расщепляет фруктозо-1-фосфат на фосфодиоксиацетат и альдегид глицерина. У здоровых животных фруктозе-1-фосфатальдолаза обычно отсут­ствует или имеется в незначительных количествах, но обнаружи­вается в сыворотке крови при остром гепатите, что является важ­ным диагностическим тестом в подобных случаях, более ранним, чем повышение активности альдолазы. Кроме того, альдолаза в отличие от этого энзима обнаруживается в различных органах при их патологии. Следует отметить, что появление и повыше­ние активности фруктозо-1-фосфатальдолазы в сыворотке крови свидетельствует о поражении паренхимы печени при условии, что исключается заболевание почек, также вызывающее активи­зацию этого фермента. По зеркалу фруктозо-1-фосфатальдолазы в сыворотке крови можно судить о течении болезни, при насту­пающем выздоровлении ее активность снижается и исчезает со­всем. Активность фермента обычно измеряют по степени пре­вращения восстановленной формы никотинамидадениндинукле-отида (НАД • Н) в никотинамидадениндинуклеотид (НАД) в па­раллельной обменной реакции:

Активность сывороточной фруктозо-1-фосфатальдолазы опре­деляют с помощью оптического теста Варбурга.

Креатинфосфокиназа(креатинкиназа) катализирует обратимую реакцию:

Она содержится только в мышечной ткани, особенно попереч­нополосатой, что делает повышение ее активности патогномонич-ным для повреждения миокарда, а также скелетных мышц. Ин­фекционные и токсические миокардиты обычно протекают со значительной гиперкреатинфосфокиназемией.

Активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови определя­ют по методу Миллера. Принцип метода состоит в образовании в сильнокислой среде креатина и фосфата из креатинфосфата. За­тем колориметрически измеряют образовавшийся при этом орга­нический фосфат.

За единицу активности креатинфосфокиназы принимают фер­ментную активность 1 мл сыворотки крови, которая в стандарт­ных условиях расщепляет за 1 мин 1 мкмоль/л фосфокреатина, определенного в виде неорганического фосфата.

Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по методу Эннера и Розенберга в модификации Гринио и Консисторума основано на образовании под действием фермента креатина из сыворотки крови в инкубационной смеси, содержа­щей креатинфосфат и АДФ. Креатин определяют посредством цветной реакции с α-нафтолом и диацетилом. Об активности эн­зима судят по количеству образовавшегося креатина, измеряя ин­тенсивность окраски реактивов.

Активность энзима пропорциональна разности экстинкций между опытным и контрольным определениями. Расчет произво­дят по стандартной кривой, построенной по креатину. За единицу активности принимают ферментную активность, при которой в 0,1 мл сыворотки в течение 30 мин при 37 °С образуется 1 мкг кре­атина. В норме активность составляет 0,2—4,0 ед.

Сорбитдегидрогеназа(алкогольдегидрогеназа) катализирует об­ратимую реакцию:

Оптимум активности фермента отмечается при рН 8,0. В боль­ших количествах он содержится лишь в печени. В сыворотке кро­ви здоровых животных фермент отсутствует. Будучи специфичес­ким для печени ферментом, он имеет большое клиническое зна­чение в диагностике гепатитов, особенно остропротекающих. Следует учитывать, что показатели активности фермента при ге­патитах приходят к норме раньше, чем показатели активности трансаминаз.

Сорбитдегидрогеназу в сыворотке крови определяют с помо­щью оптического теста Варбурга.

Малатдегидрогеназа(дегидрогеназа яблочной кислоты) катали­зирует последний этап трикарбонового (аэробного) цикла Кребса при участии коэнзима НАД:

Максимальная активность реакции проявляется при концент­рации яблочной кислоты, равной 0,03 М, а полумаксимальная — при 0,01 М.

Увеличение концентрации фермента в сыворотке крови обна­руживают при заболеваниях печени, тиреотоксическом зобе, ост­ром и хроническом нефрите, лимфогранулематозе, а также во вре­мя беременности. При гепатите активность фермента повышается в 10 раз и более. Значительное повышение отмечают также при инфарктах миокарда уже через 12—42 ч после заболевания.

Активность малатдегидрогеназы в сыворотке крови определяют с помощью оптического теста Варбурга.

Орнитинкарбамоилтрансферазакатализирует первый этап цикла превращений мочевины (орнитина):

В присутствии карбамоилфосфата орнитин переходит в цитру­лин.

Орнитинкарбамоилтрансфераза имеется только в печени, по­этому повышение ее активности в крови — патогномоничный признак поражения печени. В этом и состоит большое клиничес­кое значение исследования активности этого фермента.

Активность орнитинкарбамоилтрансферазы в сыворотке крови определяют по методу Райхарда в модификации Морети. Прин­цип метода состоит в том, что фермент катализирует арсенолиз цитрулина до орнитина и аммиака:

В качестве субстрата берут цитрулин и по количеству образо­вавшегося аммиака с помощью реактива Несслера судят об актив­ности энзима.

Контрольные вопросы и задания

1. Назовите общие принципы определения каталитической активности органоспецифических и соматических ферментов. 2. Какие основные типы изменения каталитической активности ферментных систем чаще выявляются при заболевани­ях животных?

Глава 11