Ассоциативные микроорганизмы тлей

АССОЦИАТИВНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ТЛЕЙ

МАГИСТАРСКАЯ РАБОТА

Студента 2 курса 242 группы

Направления подготовки магистратуры 06.04.01 Биология

Биологического факультета

Макарова Никиты Олеговича

Научный руководитель

Доцент кафедры микробиологии

и физиологии растений, к.б.н., доцент __________ Е. В. Глинская

Заведующий кафедрой

д.б.н., профессор __________ С.А. Степанов

Саратов 2017

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………..…

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ………………………………………………………….…..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………...……………………………...…...

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ……………………………

ВВЕДЕНИЕ

Ассоциации растений с микроорганизмами, стимулирующими их развитие, привлекают внимание ученых не только с точки зрения исследования фундаментальных основ сосуществования и взаимодействия различных организмов, но и возможного использования таких ассоциаций в практике экологически ориентированного адаптивного растениеводства.

Микроорганизмы, существующие внутри растения, включая надземную, подземную части и семена, и благотворно влияющие на их развитие, не вызывая симптомов заболевания (эндофитные микроорганизмы), представляют как научный, так и практический интерес.

Они используют внутреннюю среду растения – эндосферу, в качестве уникальной экологической ниши, защищающей их от изменений окружающей растение внешней среды, которая возникла в результате сотен миллионов лет совместной эволюции растений и бактерий.

Эндофитные бактерии колонизируют те же экологические ниши в растении, что и болезнетворные микроорганизмы, и поэтому служат перспективным биологическим средством для борьбы с фитопатогенами, то есть выступают в роли так называемого «биоконтрольного» агента.

В природе встречается широкий спектр примеров взаимовыгодного симбиоза. От желудочных и кишечных бактерий, без которых было бы невозможно пищеварение, до растений. Такие отношения успешны всегда, когда они увеличивают шансы обоих партнёров на выживание. Осуществляемые в ходе симбиоза действия или производимые вещества являются для партнёров существенными и незаменимыми [1].

Открытие новых групп растительных симбиозов и расширение числа видов среди таксонов растений, участвующих в образовании ранее известных, позволяет предположить, что явление симбиоза – не исключение, а скорее правило, закономерность в природе, и симбиотические ассоциации представляют собой одну из основных форм существования жизни

Изучение межорганизменных отношений в настоящее время приобрело всеобъемлющий характер и оказывает все более заметное воздействие на развитие практически всех областей биологии. Доказано, что индуцируя крупные изменения, симбиоз определяет становление новых форм жизни, которые не могли бы возникнуть при эволюции свободноживущих организмов [2].

Каждый микроорганизм приспосабливается не только к неживым субстратам, но и к другим окружающим его организмам. Подобная адаптация иногда приводит к приобретению особых метаболических свойств, наделяющих обладателя способностью занимать специфические ниши. Значительная часть бактерий участвует в конкурентной борьбе, адаптируясь к сосуществованию с другими формами жизни [3].

В последнее десятилетие происходит смена парадигмы симбиоза. На смену представлениям о них как о двухкомпонентных системах в результате уточнения знаний об этом феномене приходит понимание симбиозов как многокомпонентных систем, в которых помимо доминантного микросимбионта, существуют и ассоциативные микросимбионты [4].

В силу того, что в последнее десятилетие для многих симбиозов открыты новые многочисленные сопутствующие микроорганизмы, назрела необходимость в выявлении и понимании роли таких ассоциативных микроорганизмов симбионтов в функционировании симбиоза в целом.

В последнее десятилетие интерес в общей микробиологии переместился от изучения чистых культур микроорганизмов к новому объекту – микробному сообществу. При этом дарвиновская теория эволюции путем конкуренции видов сменилась новой «анти-рыночной» парадигмой - эволюцией видов в составе сообществ [5].

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Обзор литературы

Внеклеточные симбионты тли

Помимо внутриклеточных, очень важную роль в жизни хозяев играют внеклеточные симбионты. Исследователи доказали присутствие в пищеварительном тракте тли внеклеточных симбионтов из различных систематических групп эубактерий [21]. Однако в данный момент не до конца выявлены функции вторичных симбионтов и их значение для насекомых. Предполагается их роль в осморегуляции. Тли питаются флоэмным соком, содержащим высокие концентрации углеводов (прежде всего сахарозы и глюкозы), в связи с чем подвергаются постоянному осмотическому стрессу. Известно несколько механизмов, позволяющих насекомым избегать обезвоживания. Высокая концентрация сахарозы непосредственно уменьшает усвоение сахара, синтез олигосахаридов замедляется, тем самым снижается концентрация раствора и, следовательно, осмотическое давление [25 - 28]. Кроме того, в желудок вода дополнительно поступает из кишки, где осмотическое давление ниже.

Недавно был выявлен еще один механизм осморегуляции тлей – это потребление ксилемного сока растений. Сок ксилемы является более разбавленным, чем сок флоэмы: концентрация сахаров и аминокислот в нем не превышает 1%. Дополнительным осморегуляторным механизмом может служить способность внеклеточных симбионтов тли к использованию сахаров в качестве источника углерода и энергии, тем самым в процессе своей жизнедеятельности внеклеточные симбионты понижают концентрацию сахаров в ксилемном соке, делая его более приемлемым для насекомого [29].

Материал и методы

Работа проводилась на базе кафедры микробиологии и физиологии растений и лаборатории молекулярной биологии биологического факультета Саратовского государственного университета имени Н. Г. Чернышевского в период с 2015 по 2016 гг.

Материал исследования

Объектом исследования являлась пшеница сорта Волжанка, Жемчужина поволжья и злаковая тля (Schizaphis graminum) (рисунок 1), собранная на растениях пшеницы сорта Волжанка и Жемчужина поволжья в периоды колошения (май), цветения (июнь) и молочной спелости (июль) (рисунок 2,3) на полях ФГБНУ «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока».

Рисунок 1 – Внешний вид злаковой тля (Schizaphis graminum):

1 – основательница; 2 – нимфа; 3 – крылатая девственница;

4 – бескрылая девственница; 5 – самец [32]

А	Б
В Колошения, цветения молочная спелость Рисунок 2 – Пшеница сорта Жемчужина поволжья в периоды колошения (А), налива зерна (Б) и молочной спелости (В) [34, 35]

А Б

В

Рисунок 3 – Рожь сорта Волжанка в периоды колошения (А), налива зерна (Б) и молочной спелости (В) [34, 35]

В ходе микробиологического исследования было изучено (кол-во не помню) особей тли.

Методы исследования

Определение систематического положения насекомых проводили по определителю Блэкман, Истоп [6].

Микробиологические исследования осуществляли стандартными методами. Непосредственно перед бактериологическим посевом насекомых усыпляли, обрабатывали в 70% – ном этаноле в течение пяти мин для уничтожения микроорганизмов, обитающих на внешних покровах, затем промывали в стерильном физиологическом растворе. 10 экземпляров тлей, обработанных таким образом, растирали в ступке с 0,5 мл физиологического раствора. Установлено, что средняя масса 10 особей тлей составляет 0,005 г, таким образом, исходное разведение составляло 10^-2. По 0,1 мл полученной суспензии высевали на ГРМ – агар (Россия, Оболенск), картофельную среду (КС) следующего состава: H₂O – 1 л, картофель – 200 г, агар – 20 г [36].

Посевы инкубировали при температуре 28ºС в течение 48 – 72 ч. Затем проводили количественный учёт выделенных штаммов микроорганизмов и отсев их на скошенные питательные среды для дальнейшего изучения.

Морфологические и культуральные признаки изучали как на первичных посевах, так и на полученных чистых культурах.

В ходе исследований нами были изучены некоторые биологические свойства микроорганизмов, такие как: способность штаммов к использованию различных сахаров (глюкоза, сахароза, маннит, лактоза, ксилоза, арабиноза, мальтоза, сорбит), цитрата, способность к гидролизу крахмала, желатина, продукции сероводорода, аммиака, индола. При изучении ферментативной активности определяли наличие у выделенных штаммов каталазы и оксидазы.

Так же проводилась работа по определению устойчивости выделенных штаммов к абиотическим факторам. Нами была изучена способность штаммов к росту при различных показателях pH среды (6, 8, 11), концентрациях NaCl в среде (7, 10, 15%), действию температурного фактора (+10 и +43°С).

Определение структуры микробоценозов злаковой тли осуществляли с помощью определения индекса встречаемости и индекса общности различных видов микроорганизмов по В. Н. Беклемишеву [37] с соответствующей модификацией к изучаемым объектам.

Индекс встречаемости рассчитывали как отношение числа проб, в которых обнаружены бактерии данного вида, к общему числу проб, выраженное в процентах.

Идентификацию выделенных штаммов проводили по Определителю бактерий Берджи [38].

Далее штаммы были изучены на наличие ферментов, которые могут найти применение в различных биотехнологических производствах. Нами были выбраны следующие ферменты: пектиназа, целлюлаза и нитрогеназа. Наличие целюлазы определяли путем посева на среду Гетченсона – Клейтона, в состав которой входили (г/л): KH₂PO₄ – 1,0, MgSO₄ – 0,5, FeSO₄ – 0,01; NaNO₃ – 2,5, карбоксиметилцеллюлоза – 10, агар – 20.

Изучение способности к фиксации молекулярного азота, связанной с наличием фермента нитрогеназы, осуществляли на безазотистой среде Эшби следующего состава (г/л): маннит – 20,0, К₂HPO₄ – 0,2, MgSO₄ – 0,2, NaCl – 0,2, K₂SO₄ – 0.1, CaCO₃ – 5,0, агар – 20.0, pH 7,1 – 7,3.

Постановку всех тестов осуществляли по общепринятым методикам [39].

Результаты исследования

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микробиоценоз тлей – это активная динамическая структура. Бактерии – ассоцианты могут снижать осмотическое давление в пищеварительном канале тли за счёт активного потребления сахаров, содержащихся в растительном соке. Так же ассоциативные бактерии могут обогащать организм насекомого-хозяина азотом за счет фиксации молекулярного азота.

Изучение микробоценозов тли с растениями – это важный этап разработки новых микробиологических методов ограничения численности насекомых. Существующих биопрепаратов на основе облигатных энтомопатогенов крайне мало и они имеют ряд недостатков. Причина этого в высокой степени специализации таких микроорганизмов: гибель насекомых влечет за собой отмирание самих возбудителей бактериозов.

АССОЦИАТИВНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ТЛЕЙ

МАГИСТАРСКАЯ РАБОТА

Студента 2 курса 242 группы

Направления подготовки магистратуры 06.04.01 Биология

Биологического факультета

Макарова Никиты Олеговича

Научный руководитель

Доцент кафедры микробиологии

и физиологии растений, к.б.н., доцент __________ Е. В. Глинская

Заведующий кафедрой

д.б.н., профессор __________ С.А. Степанов

Саратов 2017

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………………..…

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ………………………………………………………….…..

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………...……………………………...…...

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ……………………………

ВВЕДЕНИЕ

Ассоциации растений с микроорганизмами, стимулирующими их развитие, привлекают внимание ученых не только с точки зрения исследования фундаментальных основ сосуществования и взаимодействия различных организмов, но и возможного использования таких ассоциаций в практике экологически ориентированного адаптивного растениеводства.

Микроорганизмы, существующие внутри растения, включая надземную, подземную части и семена, и благотворно влияющие на их развитие, не вызывая симптомов заболевания (эндофитные микроорганизмы), представляют как научный, так и практический интерес.

Они используют внутреннюю среду растения – эндосферу, в качестве уникальной экологической ниши, защищающей их от изменений окружающей растение внешней среды, которая возникла в результате сотен миллионов лет совместной эволюции растений и бактерий.

Эндофитные бактерии колонизируют те же экологические ниши в растении, что и болезнетворные микроорганизмы, и поэтому служат перспективным биологическим средством для борьбы с фитопатогенами, то есть выступают в роли так называемого «биоконтрольного» агента.

В природе встречается широкий спектр примеров взаимовыгодного симбиоза. От желудочных и кишечных бактерий, без которых было бы невозможно пищеварение, до растений. Такие отношения успешны всегда, когда они увеличивают шансы обоих партнёров на выживание. Осуществляемые в ходе симбиоза действия или производимые вещества являются для партнёров существенными и незаменимыми [1].

Открытие новых групп растительных симбиозов и расширение числа видов среди таксонов растений, участвующих в образовании ранее известных, позволяет предположить, что явление симбиоза – не исключение, а скорее правило, закономерность в природе, и симбиотические ассоциации представляют собой одну из основных форм существования жизни

Изучение межорганизменных отношений в настоящее время приобрело всеобъемлющий характер и оказывает все более заметное воздействие на развитие практически всех областей биологии. Доказано, что индуцируя крупные изменения, симбиоз определяет становление новых форм жизни, которые не могли бы возникнуть при эволюции свободноживущих организмов [2].

Каждый микроорганизм приспосабливается не только к неживым субстратам, но и к другим окружающим его организмам. Подобная адаптация иногда приводит к приобретению особых метаболических свойств, наделяющих обладателя способностью занимать специфические ниши. Значительная часть бактерий участвует в конкурентной борьбе, адаптируясь к сосуществованию с другими формами жизни [3].

В последнее десятилетие происходит смена парадигмы симбиоза. На смену представлениям о них как о двухкомпонентных системах в результате уточнения знаний об этом феномене приходит понимание симбиозов как многокомпонентных систем, в которых помимо доминантного микросимбионта, существуют и ассоциативные микросимбионты [4].

В силу того, что в последнее десятилетие для многих симбиозов открыты новые многочисленные сопутствующие микроорганизмы, назрела необходимость в выявлении и понимании роли таких ассоциативных микроорганизмов симбионтов в функционировании симбиоза в целом.

В последнее десятилетие интерес в общей микробиологии переместился от изучения чистых культур микроорганизмов к новому объекту – микробному сообществу. При этом дарвиновская теория эволюции путем конкуренции видов сменилась новой «анти-рыночной» парадигмой - эволюцией видов в составе сообществ [5].

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Обзор литературы