Техника безопасности при работе в
Микробиологической лаборатории
Не входить в лабораторию в пальто, головном уборе, не вносить посторонние вещи.
Приступать к занятиям, только надев хлопчатобумажный халат.
Строго соблюдать правила обращения с химическими реактивами и красителями.
С большой осторожностью пользоваться смесью спирта с эфиром, не переносить ее на столы с горелками.
Поскольку некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов, являются аллергенами, не допускать их распыления - не оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами микроорганизмов.
Перед тем как набирать ртом с помощью пипетки суспензии микроорганизмов или реактивы, убедиться в том, что пипетка закрыта с тупого конца ватой.
В лаборатории поддерживать порядок и чистоту. По окончании занятий протирать иммерсионный объектив микроскопа мягкой тканью, накрывать микроскоп полиэтиленовым чехлом, приводить в порядок рабочее место, мыть руки.
Помнить о том, что студенты несут ответственность за используемые ими микроскопы, другое лабораторное оборудование, чистоту рабочего места.
Перед уходом из лаборатории дежурному проверять, выключены ли газ, вода, электроприборы.
Общие сведения о работе с микроорганизмами
Питательные среды
Одной из основных задач экологии микроорганизмов является выявление численности и разнообразия микроорганизмов в объекте исследования. Численность микроорганизмов выражается в колониеобразующих единицах (КОЕ). Выделение и учет численности микроорганизмов производят при их выращивании на различных питательных средах. Однако универсальной среды, на которой выделялись бы все существующие в конкретном объекте микроорганизмы, нет. Относительно универсальная среда на основе мясного бульона была предложена немецким ученым Р. Кохом. На ней хорошо развиваются микроорганизмы, использующие органические азотсодержащие соединения.
Для анализа определенных групп микроорганизмов в практику микробиологии С.Н. Виноградским были введены элективные, или избирательные, среды. Они составлены в расчете на предельно строгие условия, при которых должен развиваться только избранный микроорганизм и никакой другой. Основной принцип элективных сред – учет избирательных потребностей микроорганизма в специфических условиях развития. Зная физиологические особенности соответствующей группы микроорганизмов, можно подобрать не только химический состав среды, но и такие условия культивирования (активную кислотность среды, условия аэрации, температуру и т.д.), при которых создается лабораторная имитация экологической ниши естественных условий обитания. Примером элективных сред могут служить среды для азотфиксаторов, нитрификаторов. Эти среды применяют в основном для выделения микроорганизмов из природных сред обитания и получения их накопительных культур. Для культивирования избранных микроорганизмов используют также оптимальные среды. Основной принцип оптимальных сред заключается в создании наиболее благоприятных условий внесением в среду различных стимулирующих рост добавок (витаминов, микроэлементов, ростовых веществ).
По составу питательные среды подразделяются на естественные (натуральные) и синтетические.
Естественными называют среды, состоящие из продуктов животного или растительного происхождения и имеющие сложный неопределенный химический состав. Это - различные части растений, животные ткани, солод, дрожжи, навоз, почва, вода морей, озер, минеральных источников. Их используют в качестве экстрактов или настоев. На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в них есть все компоненты, необходимые для роста. В то же время эти среды малопригодны для изучения физиологии обмена веществ у микроорганизмов, так как неопределенность их состава не позволяет учесть потребление компонентов среды и накопление продуктов обмена. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.
Синтетические – это такие среды, в состав которых входят известные химически чистые соединения в строго указанных концентрациях. Синтетические среды бывают простыми и сложными по составу. Именно эти среды используют для исследований, посвященных изучению обмена веществ у микроорганизмов.
Кроме этого, существуют и полусинтетическиесреды, относящиеся к средам с неопределенным составом. В них наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Например, в среду с мясным бульоном могут входить пептон, глюкоза или сахароза, поваренная соль, фосфат калия и т.д.
Питательные среды могут быть различной консистенции – плотные, жидкие и полужидкие.
Плотные питательные среды готовят из жидких сред, добавляя 1,2-2% агара или 10-15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносят 0,1-0,2% агара.
Агар – это растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят в основном полисахариды, а также ничтожно малое количество азотистых веществ. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата питания, и поэтому агар удобен как инертный уплотнитель среды. Температура плавления агара – 1000С, затвердевания - 400С.
Желатина - кислый азотсодержащий продукт, добываемый при выварке костей, хрящей, сухожилий, чешуи рыб. Температура плавления желатины (22-250С) ниже температуры культивирования большинства микроорганизмов, что ограничивает ее применение в качестве уплотняющего средства.
Плотными питательными средами служат также гелевые пластины. Прописи приготовления некоторых питательных сред представлены в приложении 1.
Методы стерилизации
Стерилизация – это полное уничтожение клеток микроорганизмов в питательных средах, посуде и т.д. Известно несколько методов стерилизации, остановимся на наиболее распространенных. Чаще всего применяют стерилизацию нагреванием.
Фламбирование или прокаливание. Применяют для стерилизации платиновых петель, игл, шпателей, ножниц, ланцетов, пинцетов непосредственно перед их использованием.
Стерилизация сухим жаром. Применяют для обработки посуды и сухих материалов, например, крахмала, мела. Стерилизуемый объект выдерживают при температуре 1700С в течение 2 часов (считая с момента установления необходимой температуры) в печи Пастера или электросушильных шкафах. Не рекомендуется поднимать температуру выше 1700С, так как ватные пробки и бумага начинают разрушаться (буреют, становятся ломкими).
Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают ватными пробками и обертывают бумагой. Чашки Петри, пробирки, пипетки, вату, марлю заворачивают в бумагу или помещают с особые футляры и пеналы, в которых стерильная посуда может храниться после стерилизации.
Стерилизация насыщенным паром под давлением. Наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые споры. С его помощью стерилизуют большинство питательных сред, посуду. Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающемся толстостенном котле – автоклаве. Надежная стерилизация достигается нагреванием при 1200С и давлении 1 атм в течение 20 мин.
Пастеризация. Представляет собой неполную, или частичную, стерилизацию, что означает нагревание при 65-800С в течение соответственно 30-10 минут с последующим быстрым охлаждением. Прием предложен для уничтожения неспорообразующих бактерий в продуктах, чьи свойства ухудшаются при кипячении, например, молоко, пиво, вино и т.д.
Холодная стерилизация (фильтрование через мелкопористые фильтры). Применяют для стерилизации сред, компоненты которых легко разлагаются при нагревании. Через мелкие поры фильтра проходят только ультрамикроорганизмы – вирусы, бактериофаги.