Подготовка проб для исследования и посев микроорганизмов
Отобранные навески по 10 г (1 г) исследуемого объекта вносят в стерильные колбочки без потерь, смывают 90 мл (99 мл) стерильной воды (разведение 1:10). Колбы закрывают ватными пробками и тщательно перемешивают не менее 10 мин. Далее берут стерильно 1 мл суспензии и помещают в 9 мл стерильной воды или физиологического раствора, затем последовательно новой пипеткой переносят по 1 мл раствора в ряд пробирок с 9 мл стерильной воды (см. схему).
Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном образце.
|
|
|
|
|
|
Рисунок 21 - Схема приготовления разведений и посева
Из пробирки с последним разведением, после тщательного перемешивания, производят высев на поверхность питательной среды. Посев производят пипеткой. Объём внесённой суспензии распределяют по поверхности стерильным шпателем.
Чашки Петри с засеянными средами помещают в термостат при определенной температуре, благоприятной для развития учитываемых микроорганизмов. Подсчет выросших колоний проводят через 3-5 суток после посева. Колонии, как правило, считают, не открывая чашки Петри, повернув их кверху дном. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют.
Зная число выросших колоний и степень разбавления, легко определить количество микроорганизмов в 1 мл исследуемой суспензии, пользуясь формулой:
|
|
N = ,где N – количество микроорганизмов в 1 г продукта;
а – количество колоний в чашке Петри;
К – разведение, из которого был проведен высев;
V – объем суспензии, взятый для посева, мл;
b – масса навеки продукта, взятой для приготовления смыва.
Точность метода зависит от числа подсчитанных колоний: лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде вырастает от 50 до 150 колоний. Для получения более надёжных результатов количество параллельно засеваемых чашек должно быть не менее 2.
3 Произвести посев воздуха методом осаждения
Посев воздуха.
Для микробиологического исследования воздуха пользуются методами, в основу которых положены оседание (седиментация), аспирация и фильтрация.
Фильтрационный метод основан на прохождении воздуха через стерилизованную жидкую или плотные (ватные фильтры) среды, удерживающие все проходящие через них взвешенные частицы, в том числе и микробов, и последующем высеве 1 мл жидкости или смыва с фильтров на плотную питательную среду. Для этого используют прибор Дьяконова.
Удобным является метод с использованием мембранных ультрафильтров, основанный на пропуске определённого объёма воздуха через фильтр с последующим его посевом на поверхность плотных питательных сред.
Аспирационный метод заключается в том, что определённый объём воздуха пропускают через специальные приборы, например прибор Кротова. Механизм улавливания микрофлоры основывается на ударно-прибивном действии струи воздуха, который проходит через узкую клиновидную щель и с большой скоростью ударяется о влажную поверхность питательной среды.
Метод оседания – простейший метод бактериологического исследования воздуха, который основан на оседании бактериальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. Чашки со средой экспонируют 5-10-15 мин в зависимости от предлагаемого бактериального загрязнения. Посев воздуха следует производить на уровне дыхания сидящего или стоящего человека.
Для расчета микробного числа воздуха по Омелянскому, используют следующую формулу:
|
|
где Х – количество микробов в 1 м3 воздуха;
а – количество колоний в чашке;
b – площадь чашки, см2; t – время экспозиции;
10 – объём воздуха, из которого происходит оседание микробов за 5мин., л;
100 – площадь на которую происходит оседание, см2;
1000 – объём воздуха, л.
Этот метод дает только приблизительные результаты. На открытых чашках плохо улавливается тонкодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц, а задерживаются главным образом крупные пылевые частицы, которые оседают и прибиваются токами воздуха к поверхности среды. Метод не учитывает скорости движения воздуха и других факторов. Тем не менее, метод может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют более совершенные приборы и методы, и когда нет источника электроэнергии.
Если в среднем в одной чашке Петри (при экспозиции в течение 5 мин) выросло до 200 колоний, воздух считается чистым, свыше 200 колоний – загрязненным.
Для точного количественного определения микроорганизмов в 1 м3 воздуха используют фильтрационный и аспирационный методы.
Вопросы к защите лабораторной работы
1 Что означает понятие «культивирование микроорганизмов», «культура», «колония», «штамм»?
2 Перечислите виды питательных сред по их происхождению.
3 Перечислите виды питательных сред по их назначению.
4 Перечислите виды питательных сред по их составу.
5 Перечислите виды питательных сред по их физическому состоянию.
6 Какие техники посева микроорганизмов на питательные среды вы знаете?
7 Виды культивирования микроорганизмов.
8 Стерилизация, её виды и назначение.