Посев и культивирование микроорганизмов на питательных средах

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3

по курсу «Основы биотехнологии»

ПОСЕВ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Методические указания

Волгоград 2002

УДК 576.6:579.6

Методические указания к лабораторной работе по курсу «Основы биотехнологии»

/Cост. И.В.Владимцева, Т.В.Хохлова, О.В.Колотова, Л.В.Федотова

Волгоградский государственный технический университет.

Волгоград, 2003. - 12 с.

Методические указания содержат сведения по способам и технике посева и культивирования микроорганизмов на плотных и в жидких питательных средах. Приводится описание методик определения концентрации биомассы и процента жизнеспособности микробной популяции.

Печатаются по решению редакционно-издательского Совета Волгоградского государственного технического университета.

Рецензент

д.т.н., проф. О. И. Тужиков

(с)

Волгоградский

государственный

технический

университет, 2002

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

1. Изучить методы, технику посева и культивирования микроорганизмов на плотных и в жидких питательных средах.

2. Изучить и практически освоить методики определения концентрации биомассы и процента жизнеспособности микробной популяции.

ПОСЕВ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ

Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием ( от лат. сultus - выращивание), а развивающиеся в среде микроорганизмы - культурой.

При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензии (в виде диффузной мути), осадок или пленку. На плотных питательных средах микробы образуют различные но форме и величине колонии, ко­торые представляют собой видимые скопления особей одного вида мик­роорганизмов, образующихся в результате размножения из одной клет­ки.

Колонии бывают плоскими, выпуклыми, куполообразными, вдавлен­ными; их поверхность-гладкой (S - формы), шероховатой (R - фор­мы), исчерченной, бугристой; края - ровными, зазубренными, бахром­чатыми. Форма колоний также разнообразна: круглая, розеткообразная, звездчатая. По величине колонки подразделяют на крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

Колонии отличаются по консистенции, плотности, цвету. Они бы­вают прозрачными и непрозрачными, окрашенными и бесцветными, влаж­ными, сухими и слизистыми.

Культура может быть чистой, т.е. содержать потомство клеток только одного вида. Внесение клеток микроорганизмов в стерильную питательную среду для получения чистой культуры называют посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (сте­рильную) называют пересевом или пассированием.

Обычно микроорганизмы выращивают при определенной постоянной температуре в термостатах (деревянных или металлических шкафах) или в термостатных комнатах. В тех и других постоянную температу­ру поддерживают при помощи терморегуляторов. Культивирование при определенной температуре называют инкубацией или инкубированием.

Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах, чашках Петри, бактериологических матрацах. В пробирках микробы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур пробирки обычно заполняют на 1/3 объема, для анаэробных - на 2/3 объема. Плотную среду наливают в пробирки на 1/3 - 1/4 объема, после ее стерилизации пробирки с еще не застывшей средой раскладывают в наклонном под небольшим ут­лом положении для получения скошенной поверхности. Это так назы­ваемые "косяки"- косые или скошенные среды.

Микроорганизмы в колбах культивируют только в жидких питатель­ных средах. Для аэробных микробов среду наливают тонким слоем (на­пример, 30 мл в колбы на 100 мл), для анаэробных – колбу заполняют на 2/3 объёма.

В чашках Петри микроорганизмы культивируют лишь на плотных средах. Высота этой посуды 1,5 см, диаметр 8-10 см, причем диа­метр верхней чашки несколько больше диаметра нижней. Перед посевом в чашке Петри со стороны дна и на пробирках в верхней трети подпи­сывают название засеваемого материала и дату посева.

Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли или шпатели. Их изготавливают из платиновой проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держа­телях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина петель 0,5 мм. Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовывать в конце петли тонкую прозрачную плёнку - "зеркало". Пипетками пользуются в том случае, когда мате­риал засевают в большом или точно отмеряемом объеме. Способ взятия плотного материала определяется его консистенцией. При посевах ча­ще всего пользуются бактериальной петлей.

Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, проводят над пламенем горелок. Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредственно перед взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при пересеве микробной культуры с про­бирки горячую петлю погружают в конденсационную жидкость, а при пересеве с чашек Петри прикасаются к поверхности питательной сре­ды, свободной от микробного роста. Достаточно остуженная петля не вызывает шипения конденсационной жидкости и не растапливает агар, при соприкосновении со средой. После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней культуры. Пипет­ки и шпатели, используемые для посевов, после использования опускают в дезинфицирующий раствор.

При посеве в жидкую питательную среду культуру, находящуюся на петле, растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой сре­дой. Взвесь микроорганизмов, набираемую в пипетку, вливают в питательную среду. При посеве на скошенный агар пробирку с питатель­ной средой держат в наклонном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха. Петлю скультурой вво­дят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрихи снизу вверх, от од­ной стенки пробирки к другой. При посеве на поверхность питатель­ной среды в чашке Петри чашку держат в левой руке. Крышку приотк­рывают настолько, чтобы в образовавшуюся щель свободно проходила петля. Небольшое количество культуры берут бактериальной петлей и легким движением, не разрезая среды, проводят прямую черту по диаметру чашки Петри. Далее бактериальную петлю кладут плашмя на плотную среду у края чашки (в начале черты) и проводят штрихи по всей среде перпендикулярно линии нанесенной культуры. Нужно ста­раться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и да­ет возможность получить изолированные колонии микробов.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой ха­рактер микробного роста получил название сплошного; или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количест­ва микробной культуры одного вида.