Критерии выбора микроорганизмов, нормирование которых предусмотрено

Фармакопеей:

• Опасность для здоровья населения;

• Способность служить критерием оценки гигиенического состояния производства, предусмотренного правилами GMP;

• В настоящее время признан достаточным для получения результатов, адекватно отражающих качество продукции по микробиологическим показателям;

• Со временем может быть расширен. Критерии приемлемости для микробиологической чистоты нестерильных субстанций для фармацевтического использования (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4., ЕР

Критерии приемлемости для микробиологической чистоты нестерильных субстанций для фармацевтического использования (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4., национальные требования)

Фармакопейные методы определения микробиологической чистоты нестерильной продукции, принцип методов. Питательные среды, используемые для определения микробиологической чистоты. Проверка пригодности питательных сред, используемых для проведения испытаний на микробиологическую чистоту.

Методы определения микробиологической чистоты нестерильных ЛС (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 2.6.12)

1.Метод высева на чашки Петри с питательной средой: - метод глубинного посева

- метод поверхностного посева

2. Метод мембранной фильтрации

3. Метод наиболее вероятного числа (наименее точный метод, используется для продуктов с очень низкой бионагрузкой).

Принцип: методы основаны на посеве на/в питательные среды определенного количества образца препарата, инкубировании, подсчете выросших колоний и выявлении специфических микроорганизмов, интерпретации полученных результатов. Питательные среды, используемые для определения микробиологической чистоты

Возможность обнаружения микроорганизмов-контаминантов в испытании в присутствии испытуемого продукта (ЛС или АФИ или вспомогательное вещество) должна быть доказана.

1. Проверка пригодности питательных сред

А. Проверке подлежит каждая партия приготовленных питательных сред (~ 5% от количества в партии);

Б. Проверка стерильности: термостатируют образец каждой серии питательной среды после ее стерилизации в течении 5-ти суток при 30-35°С (если среда используется для выявления бактерий) и 20-25°С (если среда используется для выявления грибов). По истечении заданного срока на (в) питательных средах должны отсутствовать визуально определяемые признаки роста микроорганизмов.

В. Проверка ростовых свойств: • Ростовые качества питательных сред обеспечиваются двумя факторами:

- наличием питательных веществ (пептиды, углеводы) и факторов роста, таких как аминокислоты, витамины, микроэлементы и пр.

- отсутствием ингибиторов роста микроорганизмов, например, остатков протеолитических ферментов, примесей тяжелых металлов, антибиотических веществ, и т.д.;

• Контролем при определении ростовых качеств среды служит:

- стандартная среда с гарантированными ростовыми свойствами, на котором правильно проявляется количественный и качественный рост микроорганизмов (морфология колоний);

- в случае отсутствия стандартной среды для контроля ростовых свойств в качестве контроля используют некоторое количество среды из предыдущей партии.

- Селективные и диагностические среды должны избирательно поддерживать рост определенного вида (видов) микроорганизмов, характерным образом его идентифицировать (например, цвет колонии, зона ферментации вокруг колонии) и подавлять другие виды.

, Используют эталонные тест-культуры микроорганизмов:

- Staphylococcus aureus

- Pseudomonas aeruginosa

- Bacillus subtilis

- Candida albicans

- Aspergillus brasiliensis

• Каждая партия питательной среды (жидкой и агаризованной) должна быть проверена отдельно для каждого организма:

- Агаризованная среда и бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов или агаризованная среда №1 должны быть проверены с использованием всех бактериальных штаммов;

- Декстрозный агар Сабуро или агаризованная среда №2 должны быть проверены с использованием Candida albicans и Aspergillus brasiliensis.

• Используют суспензии тест-штаммов, содержащие ~ 100 КОЕ/мл : - Каждый штамм выращивают отдельно в пробирках на соответствующей питательной среде (ГФ РБ таблица 2.6.12.-1 для ОКА и ОКГ, 2.6.13.-1 для специфических микроорганизмов). Тест-штаммы аэробных бактерий выращивают при 30-35 °С в течение 18-24 часов; тест- штаммы грибов выращивают при 20-25°С в течение 2 суток (Candida albicans), 5 суток (Aspergillus brasiliensis).

- Готовят исходную суспензию каждого штамма смывом с поверхности агара буфером (ГФ РБ), для лучшего суспендирования грибных спор используют ПАВ – полисорбат 80 – в количестве 0,05%.

- Оптическую плотность исходной суспензии сравнивают с оптической плотностью стандарта мутности 0,5 по МакФарланду (MсFarland). Совпадение оптических плотностей означает,

что исходная суспензия содержит ~ 10 8 КОЕ/мл. - Из исходных суспензий готовят рабочие суспензии серией десятикратных разведений в том же растворителе до концентрации 100 КОЕ/мл. Приготовленные суспензии используют в течение 2 ч. или, при условии хранения при температуре 2-8 °С, в течение 24 ч. - Чашки с агаризованными средами или емкости с жидкими средами инокулируют соответствующим микроорганизмом в количестве ~ 100 КОЕ (1 мл рабочей суспензии с концентрацией 100 КОЕ/мл). Инкубируют в подходящих условиях в течение требуемого для бактерий и грибов времени (ГФ РБ).

- Контроль: инокулированные среды из предыдущей партии.

- Отрицательный контроль: контролю подвергается растворитель, используемый для приготовления исходной и рабочей суспезий тест-микрорганизмов, путем высева на питательные среды. Не должно наблюдаться роста микроорганизмов. - Учет и интерпретация результатов:

? Для агаризованных сред: подсчитывают число выросших колоний. Найденное значение не должно отличаться от значения, полученного для предыдущей партии среды более чем в 2 раза.

? Для жидких сред: должен обнаруживаться отчетливо заметный рост микроорганизмов в сравнении с ростом, который получен с использованием среды из предыдущей партии.

- Для селективных питательных сред, используемых для выявления специфических микроорганизмов, подтверждают ростовые, ингибирующие рост и индикаторные свойства Испытания на ингибирующие рост свойства питательных сред:

Питательную среду инокулируют ~ 100 КОЕ подходящего микроорганизма и инкубируют при определенной температуре в течение определенного периода времени

Результат: не должен наблюдаться рост микроорганизмов, для которых данная среда не является селективной. Испытания на индикаторные свойства.

Выполняют методом поверхностного посева, инокулируя каждую чашку ~ 100 КОЕ соответствующего микроорганизма. Инкубируют при определенной температуре в течение периода времени, необходимого для выявления специфического микроорганизма.

Результат: Выросшие колонии по индикаторным реакциям (цвету) должны соответствовать описанию в ГФ РБ и должны быть сравнимы с теми, которые наблюдаются на предыдущей партии партии среды.

Количество выросших колоний не должно отличаться от значения, полученного для предыдущей партии среды более чем в 2 раза.