Методика выполнения работы

1. Ознакомление с устройством микроскопа

Поскольку микробиология изучает организмы, большинство из которых невозможно рассмотреть нево­оруженным глазом, для установления их внешней формы, размеров, строения пользуются микроскопом (от греч. micros - малый, scopeo - смотрю). Это оптический прибор, состоящий из механической, осве­тительной и оптической частей (рис. 1).

Рис.1

Микроскоп 1 - основание; 2 - коробка с механиз­мом микрометрической фокусиров­ки; 3 - микрометрический винт; 4 - предметный столик; 5- 6 - винты для перемещения предметного столика; 7 - тубусодержатель; 8 - макрометрический винт; 9 - головка; 10 - тубусс окуляром; 11 - винт для крепления насадки; 12 - револьвер с объективами; 13 - винт, фиксирующий револьвер относительно оси тубуса; 14 - крон­штейн конденсора; 15 - винт пере­мещения конденсора; 16 - конден­сор; 17 - винт для крепления конденсора; 18 - дополнительная линза; 19 - зеркало.

Механическая часть, или штатив микроскопа, состоит из сле­дующих деталей.

Ножка подковообразной или прямоугольной формы, служащая опорой микроскопа.

Тубусодержатель имеет форму дуги и используется в каче­стве ручки при переноске микроскопа.

Тубус - зрительная трубка микроскопа. В верхнее отверстие тубуса свободно вставляется окуляр.

Револьверная насадка крепится к нижней стороне тубуса. Вращая насадку, можно быстро менять ввинченные в нее объек­тивы, во время работы, подводя под тубус любой из них. Объек­тив должен быть, центрирован, т. е. установлен в рабочее поло­жение, при котором главная оптическая ось линз объектива со­впадает с главной оптической осью линз окуляра. Для этого на верхнем диске насадки против объектива имеется желобок, в ко­торый входит ступица (пружинка), закрепляющая объектив. При попадании ступицы в желобок ощущается щелчок.

Предметный столик - устройство, на которое помещают изу­чаемый объект. Препарат, закрепляют имеющимися на столике зажимами (клеммами). В центре предметного столика находится отверстие для прохождения лучей света, освещающих препарат. Предметный столик может передвигаться в двух взаимно перпен­дикулярных направлениях с помощью двух симметрично распо­ложенных на краях столика винтов. Подвижность столика позво­ляет любую точку препарата расположить под объективом. Сто­лик может быть также закреплен неподвижно.

Винты - микро и макро. С их по­мощью тубус можно передвигать вверх и вниз для установления его на необходимом расстоянии от препарата. При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается, при вращении против часовой стрелки - поднимается. Микро­винтом пользуются для ориентировочной грубой установки объектива на «фо­кус», т.е. на то расстояние от препарата, при котором он де­лается видимым. Для точной настройки объектива служит микровинт.

Осветительная часть мик­роскопа состоит из зеркала, конденсора и ирис-диафрагмы, расположенных под предметным столиком микроскопа.

Зеркало имеет две поверхности: плоскую и вогнутую Оно отражает световые лучи и направляет их к конденсору. Обычно при работе зеркало повернуто к свету плоской стороной.

Конденсор - представляет собой систему сильных линз и служит для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта. Собирая лучи света, отраженные зеркалом, конденсор концентрирует их в плоскости препарата. Конденсор можно передвигать в вертикальном направ­лении при помощи винта.

Ирис-диафрагма, расположенная под конденсором, состоит из тонких металлических пластинок, которые при помощи ры­чажка можно сдвигать или раздвигать, в результате чего отвер­стие диафрагмы может сужаться или расширяться. Ирис-диа­фрагмой регулируют интенсивность освещения препарата. При малом раскрытии диафрагмы возрастают глубина резкости.

Оптическая часть микроскопапредставлена объективами и окуляром.

Объектив состоит из линз, заключенных в металлическую оправу. Линза, обращенная к предмету, называется фронтальной. Объектив обладает определенной увеличительной способностью иопределенной глубиной фокуса. Чем больше кривизна линз, тем короче фокусное расстояние и больше увеличение объектива. Объектив дает действительное, увеличенное, обратное изображение. На оправе каждого объектива нанесены цифры, показывающие его увеличение. Биологические микроскопы МБР-1, МБИ-1, «Биолам» и другие обычно имеют 3-4 объектива с цифровыми обозначениями 8^x,20^x,40^x,90^x, показывающими их собственное увеличение.

Объективы подразделяют на сухие и иммерсионные. При рассматривании препарата с сухим объективом (8^x, 20^x, 40^x) между его фронтальной линзой и препаратом находится воздух. Так как лучи света проходят среды с различными показателями преломления (предметное стекло, вода, покровное стекло, воздух), часть их отклоняется и не попадает в объектив. При работе с иммерсионным объективом (90^x) для устранения светорассеивания расстояние между фронтальной линзой объектива и препаратом заполняют кедровым (иммерсионным) маслом, которое подвергают специальной обработке, в результате чего его показатель преломления света становится примерно таким же, как у стекла. Коэффициент преломления такого кедрового масла равен 1,515, коэффициент преломления стекла - 1,53. Световые лучи при переходе стекла в слой кедрового масла практически не преломляются и, не отражаясь, попадают в объектив. Таким образом достигается наилучшее освещение рассматриваемого объекта. Кроме того, применение иммерсионного масла повышает разрешающую способность микроскопа.

Окуляр (от лат. oculus - глаз) вставляется в верхний конец тубуса и представляет собой систему двух плосковыпуклых линз, обращенных выпуклостью в сторону объектива. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, к препарату - собирательной. Биологические микроскопы снабжены тремя сменными окулярами. На оправе верхней линзы окуляра указано его собственное увеличение. Обычно окуляр увеличивает изображение, данное объективом в 7, 10, 15 раз. Для того чтобы определить общее увеличение используемой оптической системы, необходимо увеличение объектива умножить на увеличение окуляра.

Используя биологический микроскоп, можно рассмотреть объект размером не менее 0,2 мкм (микрометр).

Осветитель используют при микроскопировании, применяя часто электрический свет. Для работы применяют специальные осветители ОИ-7, OИ-9 и ОИ -21.

2. Правила пользования микроскопом

Работая с микроскопом, необходимо соблюдать определенные правила обращения с ним.

· Микроскоп вынимают из футляра и переносят к рабочему месту, держа его одной рукой за ручку штатива, а другой, поддерживая за ножку штатива. Наклонять микроскоп в сторону нельзя, так как окуляр может выпасть из тубуса.

· Микроскоп помещают на рабочем столе на расстоянии 3 - 5 см от края стола ручкой к себе.

· Устанавливают правильное освещение поля зре­ния микроскопа. Для этого, смотря в окуляр микро­скопа, зеркалом направляют луч света от настоль­ного осветителя (являющегося источником света) в объектив. Настройка освещения производится с объ­ективом 8^х. При правильной установке поле зрения микроскопа будет выглядеть в виде круга, хорошо и равномерно освещенного.

· На предметный столик помещают препарат и закрепляют его клеммами.

· Сначала препарат рассматривают с объективом 8^х, затем переходят к большим увеличениям.

Для получения изображения объекта необходимо знать фокусное расстояние (расстояние между объ­ективом и препаратом). При работе с объективом 8^х расстояние между препаратом и объективом со­ставляет около 9 мм, с объективом 40^х - 0,6 мм и с объ­ективом 90^х - около 0,15 мм.

Тубус микроскопа необходимо осторожно опускать вниз с помощью макровинта, наблюдая за объективом сбоку, и приблизить его к препарату (не касаясь его) на расстояние, несколько меньшее фокусного. Затем, глядя в окуляр, тем же винтом, медленно вращая его на себя, поднимают тубус до тех пор, пока в поле зрения не появится изображе­ние изучаемого объекта.

После этого вращением микровинта фокусируют объектив так, чтобы изображение объек­тива стало четким. Микровинт нужно вращать осторожно, но не более чем на пол-оборота в ту или другую сторону.

При работе с иммерсион­ным объективом на препарат предварительно наносят каплю кедрового масла и, глядя сбоку, макровинтом осторожно опускают тубус микроско­па так, чтобы кончик объектива погрузился в каплю масла. Затем, глядя в окуляр, тем же винтом очень медленно поднимают тубус до тех пор, пока не по­явится изображение. Точную фокусировку производят микрометрическим винтом.

· При смене объективов следует вновь отрегулировать интенсивность освещения объекта. Опуская или поднимая конденсор, получают желаемую сте­пень освещенности. Например, при просмотре препа­рата с объективом 8^х конденсор опускают, при переходе на объектив 40^х – несколько поднимают, а при работе с объективом 90^х конденсор поднимают вверх до предела.

· Препарат рассматривают в нескольких местах, передвигая предметный столик боковыми винтами или передвигая стекло с препаратом вручную. При изучении препарата следует все время пользоваться микровинтом, с тем, чтобы рассмотреть препарат во всей его глубине.

· Перед заменой слабого объектива более сильным место препарата, где расположен изучаемый объект, необходимо поставить точно в центр поля зрения и только после этого по­вернуть револьвер с объективом.

· Во время микроскопирования нужно держать оба глаза открытыми и пользоваться ими попеременно.

· После окончания работы следует снять препарат. с предметного столика, опустить конденсор, поставить под тубус объектив 8^х, мягкой тканью удалить иммерсионное масло с фронтальной линзы объ­ектива 90^х и убрать микроскоп в футляр.

3. Приготовление препаратов

3.1. Приготовление препарата «раздавленная капля»

1 - краситель; 2- окрашенная часть; 3- неокрашенная часть.

Для приготовления препарата «раздавленная капля» (рис.2) на середину предметного стекла предварительно прокаленной бактериологической петлей наносят каплю из водной суспензии, осторожно накрывают ее и «раздавливают» ее покровным стеклом. Если исследуемый объект «твердый» (например, Mucor), то вначале на предметное стекло помещают каплю воды, а затем в нее помещают объект.

Капля должна тонким слоем заполнить пространство между покровным и предметным стеклами, но не выступать за края покровного стекла.

Излишек выступившей жид­кости удаляют фильтровальной бумагой, если жидкости, мало, ее добавляют. Далее препарат помещают на предметный столик микроскопа и рассматривают с объ­ективом 40^х. Окрашивают препарат фуксином или метиленовой синью.

Капля красителя помешается рядом с покровным стеклом, затем метиленовая синь или фуксин попадают под покровное стекло (см. рис 2.)

3.2. Приготовление препарата «висячая капля»

Рис. 3

1 - предметное стекло с лункой; 2 - покровное стекло; 3 - слой вазелина 4 - крышка чашки Петри; 5 - дно чашки Петри; 6 - препарат (капля); 7 - вид сверху. Прим. Чашка Петри используется для хранения препарата.

Посредством этого препарата (рис.3) исследуют микроорганизмы в живом виде, изучая их рост, развитие. Для этого на покровное стекло наносят каплю жидкости с исследуемыми микроорганизмами. Взять специальное предметное стекло с лункой в центре и смазать ее края вазелином. Лункой предметного стекла накрыть каплю исследуемого материала так, чтобы капля находилась в центре лунки. Предметное стекло слегка прижать и быстро перевернуть его. При правильном приготовлении препарата капля свисает в лунку.

3.3. Приготовление фиксированного препарата

Рис. 4

1 - предметное стекло; 2 - препарат.

1. Подготовка предметного стекла (обезжирить).

2. Нанесение мазка. Растягиваем либо петлей, либо краем предметного стекла.

3. Высушивание мазка высоко над пламенем спиртовки.

4. Фиксация мазка тепловым способом (над пламенем) 3-4 раза.

5. Окрашивание. Если окрашиваем метиленовой синью, то залить препарат красителем на 4 -5 мин. Если фуксином, то предварительно на препарат поместить фильтровальную бумагу, смоченную водой, а затем нанести краситель на 1 -2 мин. После окрашивания необходимо снять фильтровальную бумагу.

6. Промывание мазка водой.

7. Высушивание мазка.

3.4. Техника окраски по Граму

Заключается она в следующем. На фиксированный мазок наносят 2-3 капли раствора генцианвиолета и через 2-3 мин. окрашивания раствор сливают. На препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и спустя 2-3 мин сливают. Препарат на 30-40 с. погружают в ста­канчик с 96 %-ным раствором спирта и быстро промывают во­дой. Затем препарат в течение 1-2 мин. докрашивают разведен­ным фуксином, промывают водой и просушивают фильтроваль­ной бумагой. Грамположителъные бактерии будут фиолетовыми, грамотрицательные - розоватые, так как обесцвеченные спиртом, они воспринимают дополнительную окраску фуксином.

4. Оформление результатов

· Напишите, из каких двух греческих слов (также укажите их перевод) состоит термин «микроскоп».

· Впишите в таблицу части микроскопа, элементы микроскопа и их назначение.

Часть микроскопа	Название элемента микроскопа	Назначение элемента микроскопа

· Напишите, от какого латинского слова (также укажите его перевод) произошел термин окуляр.

· Рассчитайте общее увеличение микроскопа,еслиприменяли объектив 8^х и окуляр 10^х.

· Запишите методику приготовления препарата «раздавленная капля».

· Запишите методику приготовления препарата «висячая капля».

· Методика приготовления фиксированного препарата.

· Запишите методику окраски по Граму.

5. Домашнее задание

Подготовиться к защите лабораторной работы №1

Вопросы для контроля

1. Строение микроскопа.

2. Правила пользования микроскопом.

3. Методика приготовления препарата «раздавленная капля».

4. Методика приготовления препарата «висячая капля».

5. Методика приготовления фиксированного препарата.

6. Техника окраски по Граму.