Работа 11. Изучение п-гидроксилирования анилина гепатоцитами крыс

Выделение гепатоцитов белых лабораторных крыс.

Гепатоциты – крупные паренхиматозные клетки печени, размером 10-20 мкм, составляющие 78-80 % массы ткани печени, осуществляющие ферментативные реакции метаболизма ксенобиотиков, в том числе реакции гидроксилирования различных по химической природе соединений.

Материалы и оборудование.

Печень белых лабораторных крыс – 2 шт., модифицированная среда Хенкса (раствор сахарозы 0,25 моль/см³, KCl – 0.065 моль/см³, Na₂HPO₄ – 0.0004 моль/см³, KH₂PO₄ – 0.0004 моль/см³, дитиотреитол – 0,002 моль/см³, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) – 0,0001 моль/см³, бычий сывороточный альбумин (БСА) – 1%, рН = 7,4), шприц для перфузии, лигатура (кетгут), мешалка, механическая подвеска, камера со смесью О₂ и СО₂ (95 и 5 % соответственно), перфоратор, найлоновая ткань, центрифуга, раствор трипанового синего 0,1 %, микроскоп.

Ход работы.

Животных декапитируют, вскрывают грудную и брюшную полости. Через нижнюю полую вену перфузируют печень модифицированной средой Хенкса. Затем на нижнюю полую вену накладывают лигатуры, печень извлекают и прикрепляют за концы лигатур к устанавливаемой вертикально механической мешалке. Мешалку помещают в силиконизированный стакан с 40 см³ среды (на 1 печень) и инкубируют в течение 15 минут при 37 ^оС при скорости вращения мешалки 60-80 об/мин. В ходе инкубации в среду пропускают смесь кислорода и углекислого газа. После этого печень раздавливают перфорированной пластиной (диаметр отверстий – 3 мм), фильтруют через 4 слоя найлоновой ткани и центрифугируют фильтрат 2 мин при 40 g (630 об/мин). Осадок дважды промывают указанной средой (по 40 см³) с последующим центрифугированием 1 мин при 40 g.

Окрашивание гепатоцитов (суспензию в среде Хенкса (1:100) проводят с помощью 0,1%-ного раствора трипанового синего. Препарат наблюдают под микроскопом.

11.2. п-Гидроксилирование анилина гепатоцитами крыс in vitro.

Реакция п-гидроксилирования анилина протекает в гепатоцитах с участием монооксигеназы со смешанной функцией – цитохрома Р-450 в присутствии НАДФН и кослорода:

п-Аминофенол в присутствии Na₂CO₃ образует с фенолом соединение синего цвета – п-аминофенолиндофенон:

Материалы и оборудование.

Гепатоциты печени крыс, трис- HCl буфер, анилин, 10-%ный раствор Na₂CO₃, 2 %-ный раствор фенола (приготовленный на 0,2 М растворе NaOH), пробирки, пипетки, термостат, встряхиватель.

Гепатоциты, выделенные из одной печени крысы, суспендируют в 10 см³ трис-HCl буфера.

Инкубационная смесь содержит в 1 см³ 40 ммоль трис-HCl буферного раствора (рН=7,4), 16 ммоль MgCl₂, 3 ммоль НАДФН, 0,1 см³ суспензии гепатоцитов и анилин в концентрации 3*10^-3 моль/дм³ (добавляют непосредственно перед началом реакции).

Реакционную смесь объемом 10 см³ инкубируют при 37 ^оС в течение 2-5-10-15-20 мин при постоянном встряхивании (250 об/мин, 5 амплитуда). Через указанные промежутки времени отбирают 1 см³ реакционной смеси, добавляют 0,5 см³ 10 %-ного раствора Na₂CO₃ и 1,5 см³ 2 %-ного раствора фенола, приготовленного на 0,2 М растворе NaOH. Для развития окраски пробы выдерживают на водяной бане при 37 ^оС в течении 30 мин. Оптическую плотность проб определяют при длине волны 630 нм. По формуле:

где:

С – концентрация образовавшегося п-аминофенолиндофенона (моль/дм³);

l – толщина кюветы (1 см);

D – оптическая плотность раствора;

e - молярный показатель поглощения п-аминофенолиндофенона (13300 дм³/(моль*см).

Вычисляют концентрацию образующегося п-аминофенолиндофенона и строят график зависимости изменения его инкубации от времени инкубации. В протокол заносят ход работы, результаты исследования и формулируют выводы.

Вопросы для самоконтроля.

1. Понятие метаболизма ксенобиотиков.

2. Фазы метаболизма.

3. Реакции первой фазы метаболизма.

4. Какова роль реакций второй фазы метаболизма в процессе детоксикации?

5. Значение ферментов в биотрансформации токсических веществ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия.- М.: Медицина, 1975.-376 с.

2. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия.- Киев, гол. Изд. Объед. “Вища школа”, 1989.- 448с.

3. Крамаренко В.Ф. Химико-токсический анализ. Практикум.- Киев, гол. Изд. Обьед. “Вища школа”, 1982.-272с.

4. Белова А.В, Руководство к практическим занятиям по токсикологической химии. – М., 1976. – 232 с.

5. Лужников Е.А. Клиническая токсикология.-М.: Медицина,1999.-416 с.

6. Харкевич Д.А. Фармакология. М.: Медицина. 1996.-544 с.

7. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. М.: Высшая школа, 1985.- 768 с.

8. Руководство по токсикологии отравляющих веществ, под ред. Голикова С.Н. М.: Медицина,1972.-472с.

9. Машковский М.Д. Лекарственные средства: пособие для врачей: в 2-х т., 13-е изд. – Харьков: Торсинг, 1997.