Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена

Наиболее широко применяется для оценки хемотаксической активности нейтрофилов метод с использованием камеры Бойдена.

Основная идея, заложенная в конструкцию камеры, заключается в разделении пористым фильтром в растворе двух реагирующих компонентов: лейкоцитов и факторов, обладающих хемотаксической активностью. В зависимости от исследуемых популяций клеток диаметр пор фильтров составляет от 3 до 8 мкм. Факторы с хемотаксической активностью помещаются в нижнюю камеру и довольно быстро создают концентрационный градиент, распространяющийся через толщу фильтра. Помещенные в верхнюю камеру лейкоциты начинают активную миграцию вдоль градиента и собираются на нижней поверхности фильтра, где можно подсчитать их количество.

Подсчет клеток на нижней поверхности фильтра проводится микроскопически; выявляется число клеток, видимых в одном поле при большом увеличении.

Более надежен радиометрический метод оценки миграционной активности лейкоцитов, когда используются лейкоциты, меченные изотопами ⁵¹Сг или ⁹⁰Тс. После постановки реакции измеряют радиоактивность фильтров. Однако такой метод требует дополнительного оборудования.

Одна из модификаций метода основана на применении двойного фильтра. Суть ее в следующем. Ниже обычного фильтра помещают целлюлозонитратный фильтр. В результате миграции клетки, прошедшие через верхний пористый фильтр, падают на целлюлозонитратную мембрану. Трудности учета падающих с нижней поверхности фильтров клетки успешно преодолеваются путем использования одиночных поликарбонатных фильтров.

В качестве фильтров апробированы самые разнообразные материалы, включая целлюлозонитраты, целлюлозные эфиры и поликарбонаты. Впервые поликарбонаты использовались для изучения хемотаксиса клеток перитонеального экссудата у морских свинок, а затем были предложены для измерения хемотаксиса моноцитов крови человека. С тех пор фильтры из этого материала получили широкое распространение при постановке реакций по оценке хемотаксической активности моноцитов крови человека. Преимущество поликарбонатных фильтров состоит прежде всего в одинаковом размере пор. Кроме того, при использовании таких фильтров значительно облегчается подсчет клеточных элементов, поскольку у мигрирующих клеток не наблюдается изменений морфологических характеристик, что отнюдь не редкость при применении фильтров из других материалов.

Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro

Хотя метод довольно прост, необходимо остановиться на некоторых технических особенностях, способных существенным образом повлиять на миграционную активность и количество клеток, помещаемых в камеру.

Так как хемотаксис связан с высокой метаболической активностью клеток, необходимо соблюдать определенный температурный режим. Максимальный хемотаксис наблюдается при 37 °С. В интервале тем-

пературы от 33 до 43 °С значительных различий результатов миграции не наблюдается. Однако при экспериментальной гипотермии у свинок при температуре 29 °С отмечено снижение миграционной активности моноцитов.

Состав среды, используемой при постановке метода, не требует каких-либо специальных добавок за исключением небольшого количества белка, облегчающего миграцию клеток. Наиболее оптимальный рН среды - 7,0, хотя в некоторых случаях предпочтение отдается некоторому смещению рН в кислую сторону, что обычно характерно для воспалительной реакции in vivo. Как указывалось выше, моноциты, проходящие сквозь фильтры, могут попадать в раствор нижней камеры, и поэтому их не учитывают. Важное значение имеет время проведения реакции. При использовании поликарбонатных фильтров оптимальные сроки инкубации клеток при 37 °С - 90 мин.

Следует избегать добавления в систему нативных сывороток. Например, сыворотка человека порой содержит факторы как способствующие хемотаксу, так и его ингибирующие.

Важна также криоконсервация выделенных моноцитов. В отличие от всех других функций клеток хемотаксис у размороженных моноцитов снижен. Присутствие лимфоцитов в клеточной суспензии, загружаемой в камеру, обычно не влияет на хемотаксис моноцитов.

При соблюдении стандартных условий постановки реакции техническая вариабельность результатов составляет около 20%, что вполне допустимо. Воспроизводимость метода весьма высокая. Рекомендуется подсчитывать при микроскопии как минимум 10 случайных полей миграции на 2 идентичных фильтрах. Если перед помещением на фильтры камеры моноциты были хорошо суспендированы, разбросы подсчета клеток в отдельных полях зрения под микроскопом невелики и связаны обычно только с ошибками при самом подсчете.

В следующем разделе мы уделяем внимание ряду методических приемов оценки активности фагоцитарных клеток в генерации многочисленных медиаторных молекул (в первую очередь цитокинов и активных форм кислорода и азота). Все эти факторы врожденного иммунитета крайне важны для нормального функционирования иммунной системы, а особенно - для выявления патологических состояний, характеризующихся сниженной или повышенной выработкой подобных медиаторов.

Лабораторная работа 3-5