Настройка прямого и бокового светорассеяния, настройка дискриминатора.

Проточные цитометры Navios™ и Gallios™ регистрируют два типа светорассеяния – малоугловое и рассеяния света под углом 90°. Малоугловое светорассеяние (forward scatter, FS) представляет собой рассеяние света от поверхности клеток под малыми углами (1-19°) и пропорционально диаметру исследуемого объекта. В то время как боковое светорассеяния или рассеяния света под углом 90° (side scatter, SS) регистрирует весь свет, рассеянный или отраженный в боковом направлении, как самой клеткой, так и ее структурами (ядром, гранулами), характеризуя сложность организации цитоплазмы. Данные параметры отражают особенности морфологического строения исследуемого объекта. Используя данные характеристики по гистограмме FS против SS можно выделить три основные популяции лейкоцитов периферической крови клинически здорового донора: лимфоциты (высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, малые размеры и отсутствие сложных образований в цитоплазме), моноциты (более крупные клетки с неспецифическими гранулами – лизосомами – в цитоплазмы) и гранулоциты (еще более крупные клетки, имеющие сложное ядро, специфические и неспецифические гранулы в цитоплазме).

При настройке данных параметров необходимо выставить напряжение на датчиках FS и SS так, чтобы на гистограмме Вы могли одновременно видеть все три основных популяции лейкоцитов и… фрагмент дебриса! Как этого добиться?

Как только Вы запустили работу прибора с первой пробиркой (изотипический контроль по FITC), обратитесь к окошку “Cytometer Control” и увеличьте “Gain” по FS до 2, а по SS – до 5.

Для этого нажмите левой кнопкой мыши по графе “Gain” в строке “FS” (действие 1) и в появившемся меню также нажатием левой клавиши мыши выберите цифру 2 (действие 2).

Аналогично необходимо сделать и с графой “SS”, однако в этом случае “Gain” необходимо увеличить до 5.

После проведения данных манипуляций на гистограмме FS против SS появятся лейкоциты, которые будут иметь следующий вид:

Имея уже такие настройки, Вы можете увидеть популяции лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. Однако не можете провести четкое разделение на лимфоциты и дебрис (агрегаты тромбоцитов и «тени» эритроцитов).

Вам необходимо их привести к вот такому виду:

Как это сделать?

В том случае, если Вы поставили галочку напротив “Quick Set” в окне “Cytometer Control”, то на Ваши гистограммах напротив названий осей появились синие бегунки, как это показано на рисунке. Например, для корректировки напряжения по “SS”. Если Вы нажимаете левой кнопкой мыши по синему пространству справа от бегунка, то напряжение увеличивается на 10 вольт (действие 1), слева – уменьшается на 10 вольт (действие 2). Для более точной корректировки напряжения можно нажимать на начала координат, если нажимаете справа – увеличение напряжения на 1 вольт (действие 3), слева – уменьшение на 1 вольт (действие 4).

Используя эти клавиши необходимо оптимизировать настройки по прямому (FS) и боковому (SS) светорассеянию, как это было показано на предыдущем рисунке. Снизу приведены примеры некорректной настройки прямого светорассеяния.

Пример очень низкого напряжения по FS: все популяции лейкоцитов смещены в нижнюю часть гистограммы, напряжение по оси SS – оптимально. Здесь необходимо повысить напряжение по FS	Пример очень высокого напряжения по FS: популяция гранулоцитов видна лишь частично, дебрис занимает до трети поля гистограммы. Здесь необходимо понизить напряжение по FS.

Как только Вы оптимизировали настройки прямого и бокового светорассеяния, четко видите три основных популяции лейкоцитов по размере и структуре, можно переходить к настройке дискриминатора.

Настройка дискриминатора.

Как было видно из предыдущего рисунка приборы регистрируют, помимо лейкоцитов, множество различных объектов – агрегаты тромбоцитов, остатки лизированных эритроцитов и т.п. Особенно ярко и наглядно это проявляется на образцах, приготовленных по «безотмывочной» технологии (из образцов не удаляются остатки разрушенных эритроцитов). Наличие данных объектов приводит к тому, что прибор очень быстро набирает число событий, установленное для остановки сбора данных «по умолчанию». Следовательно, необходимо избавиться от регистрации лишних событий. Необходимо ввести такие значения дискриминатора, чтобы были видны все основные популяции клеток анализируемого образца, а частицы, которые не являются клетками (дебрис), не попадали в зону анализа. В приборах Navios™ и Gallios™, это ограничение «по умолчанию» ставится на канал малоуглового рассеяния света. Для того, чтобы изменить значения дискриминатора необходимо обратиться к окну “Cytometer Control”. В правой части окна напротив каждого из каналов регистрации сигнала есть графа под названием “Discr.” Для того, чтобы изменить значение дискриминатора, необходимо левой кнопкой мыши (действие 1) нажать на ячейку столбца “Discr.” Напротив интересующего Вас канала (в этом случае – FS), после чего справа в окне “Cytometer Control” у Вас активизируется серый бегунок. Нажимая левой кнопкой мыши по пространству над бегунком (действие 2), Вы можете увеличивать значения дискриминатора, тем самым поднимая порог чувствительности прибора на 10 единиц шкалы FS, если нажимаете под бегунком (действие 3) – снижаете значения дискриминатора, тем самым понижая 10 единиц шкалы FS порог чувствительности прибора. Если Вам необходима более точная настройка, то для этого предназначены боковые кнопки осе, нажатие на эти клавиши левой кнопкой мыши приводит к увеличению (действие 4) или уменьшению (действие 5) значений дискриминатора на 1.

Для примера высоких и низких значений дискриминатора было проанализировано по 10000 событий для каждой из гистограмм.

	На данном рисунке приведен пример очень низкого значения дискриминатора – в поле анализа попадает очень много посторонних частиц (дебриса). Необходимо повысить значение дискриминатора!!! Из 10000 событий более половины приходится на дебрис
	На данном рисунке приведен пример очень высокого значения дискриминатора. Обратите внимание, что часть популяции лимфоцитов на попадает в зону анализа! Необходимо понизить значения дискриминатора.
	На данном рисунке приведены оптимальные значения дискриминатора. Видны все основные популяции лейкоцитов, четко отделимые друг от друга, а между лимфоцитами и дебрисом остается свободное пространство. Дебрис ни в коем случае нельзя целиком удалять из зоны анализа, так как эти частицы в данном случае служат отличным ориентиром для того, чтобы знать, не потеряли ли мы лимфоциты при настройке!!!