Рующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклео-
тидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно
Проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом
обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты
ДНК имеют так называемые «тупые» концы. Возможно расщепление ДНК
Со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов.
Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности
Вступают во взаимодействие.
Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присое-
Динить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой),
Превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно ком-
Плиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как
Достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычлене-
ния нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды
Или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функцио-
Нально неполноценный.
Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна
Первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген.
Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот
Метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеоти-
Дов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных
Последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одно-
Цепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного об-
разования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В
настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем
Микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие
последовательности одноцепочечной ДНК. На рис. 4.2 показана схема
такой машины, сконструированной канадской фирмой «Био лоджикэлс».
Нужная последовательность оснований вводится на клавишный пульт
Управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помо-
Щью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нук-
Леотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка напол-
Нена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В дан-
Ном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со ско-
Ростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помо-
Щью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечно-
Го нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-
Цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.
Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК
(мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным мето-
Дом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присут-
Ствует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в
Подобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с
Помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить
Микропроцессор
C
Резервуары с
Нуклеотидами
Резервуары с реагентами
И растворителями
В отходы
Т
Блокирующий
Агент
Т
Т
Т
3’ 5’
Б Бусинка кремния
Насос
Синтезирующая
Колонка
К коллектору
G A
A
T
А
Р
G
С
Р
Р
А
Р
А
Р
А
Р
С
Р
С
Р
G
Р
Рис. 4.2. Схема «генной машины» (по Д. Хопвуду, 1984).
ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная
ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использо-
Ванием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит
олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК об-
Разуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.
Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г. гена гормона
Роста человека (соматотропина).
Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о
Структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны допол-
Нительные механизмы для управления действием гена.