Структура современной биотехнологии

Современная биотехнология включает ряд высоких технологий, которые базируются на последних достижениях экологии, генетики, микробиологии, цитологии, молекулярной биологии. В современной биотехнологии используются биологические системы всех уровней: от молекулярно-генетического до биогеоценотического (биосферного); при этом создаются принципиально новые биологические системы, не встречающиеся в природе. Биологические системы, используемые в биотехнологии, вместе с небиологическими компонентами (технологическое оборудование, материалы, системы энергоснабжения, контроля и управления) принято называть рабочими системами.

К основным разделам современной биотехнологии относятся: микробиологический синтез, клеточная инженерия и генная инженерия.

Микробиологический синтез (МБС)

Становление современного МБС связано с открытием антибиотиков и разработкой способов их промышленного производства с помощью актиномицетов и грибов. В настоящее время микроорганизмы используются в различных высоких технологиях: для производства антибиотиков, кормового белка и аминокислот, биологически активных соединений (витаминов, гормонов, ферментов, стимуляторов роста) и т.д.

Промышленная биотехнология

Широкое проникновение биотехнологий в экономику мирового хозяйства нашло свое отражение и в том, что сформировались даже новые термины для обозначения глобальности данного процесса.

Красная биотехнология (медицина) считается важнейшей сферой использования биотехнологий. Биотехнологический метод играет все большую роль для разработки новых медикаментов (например, для лечения рака). Биотехнологии имеют большое значение также для осуществления диагностики (чипы ДНК, биосенсоры). Красная биотехнология пользуется в Австрии заслуженным признанием и по праву считается ключевой технологией и двигателем для развития других отраслей.

Зеленая биотехнология используется в сфере современной селекции растений. С помощью биотехнологических методов разрабатываются эффективные средства против насекомых, грибков, вирусов; создаются новые формулы гербицидов. Особое значение для сферы зеленой биотехнологии имеет генная инженерия. Она создает предпосылки для переноса определенных генов одного вида на другие растения и влияет, таким образом, на развитие соответствующих устойчивых свойств и характеристик полученных сортов.

Серая биотехнология применяется в сфере охраны окружающей среды. Биотехнологические методы используются для санации почв, очистки канализационных стоков, отработанного воздуха и газов, а также для переработки отходов.

Белая биотехнология охватывает сферу применения биотехнологий в химической промышленности. В задачи белой биотехнологии входят эффективное и безопасное для окружающей среды производство таких субстанций, как алкоголь, витамины, аминокислоты, антибиотики и ферменты.

Синяя биотехнология специализируется на техническом применении организмов и процессов морской биологии. В центре исследований находятся биологические организмы Мирового океана.

Всплеск исследований по биотехнологии в мировой науке произошел в 80-х годах, когда новые методологические и методические подходы обеспечили переход к эффективному их использованию в науке и практике и возникла реальная возможность извлечь из этого максимальный экономический эффект.

Гибкость метаболизма и высокая способность микробов к адаптации, простота культивирования, изученность генетики, разработанные методы направленного создания штаммов с заданными свойствами — преимущества, делающие микробную биотехнологию одним из перспективных направлений промышленности. Целесообразность промышленного производства определяется такими факторами, как высокий выход продукта (образование больших количеств из исходного материала), низкая стоимость производства и доступность сырья.

Оптимизация микробиологических процессов в биотехнологии. Принципиальные подходы к оптимизации микробных биотехнологических процессов: управляемое культивирование (изменение состава питательной среды, целевые добавки, регуляция скорости перемешивания, аэрации, модификация температурного режима и пр.); генетические манипуляции, которые подразделяют на традиционные методы (селекция штаммов) и методы генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК).

В настоящее время микробиологическим путём получают микробную биомассу, первичные и вторичные продукты метаболизма. Первичные продукты (продукты первой фазы) — метаболиты, синтез которых необходим для выживания данного микроорганизма. Синтез вторичных продуктов (продукты второй фазы) не относится к жизненно необходимым для микроорганизма-продуцента. Оптимальные условия для получения биомассы определяются высокими скоростями протока среды через культуры микроорганизмов и стабильными химическими условиями культивирования (в том числе рН, количество кислорода и углерода). Процесс получения продуктов первой фазы (в частности, ферментов) оптимизируют в целях увеличения удельной активности фермента (единиц/г*ч^-1) и объёмной продуктивности (единиц /л*ч^-1).

Для получения продуктов второй фазы (например, антибиотиков) главная задача — максимальное увеличение их концентрации, что ведёт к снижению затрат на их выделение.

Важное направление биотехнологии — культивирование растительных клеток, образующих биологически активные вещества (БАВ). Подобный подход отменяет необходимость в закладке больших плантаций лекарственных растений и связанные с этим проблемы (уход за посевами, профилактика болезней лекарственных растений), позволяя получить нужные препараты более дешёвыми методами. Таким образом получают БАВ женьшеня, строфанта и других растений.

В общем виде схема биотехнологического производствапродуктов микробного синтеза представлена на рисунке 2.

Рис. 2. Общая схема биотехнологического производства

Существует 5 стадий биотехнологического производства.

При осуществлении микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами.

Третья стадия - стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит.

На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции.

Заключительная стадия биотехнологического производства - приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так как должны быть стерильными.

Биотехнологические процессы воспроизводства микроорганизмов могут быть основаны на периодическом или непрерывном культивировании.

Выращивание микроорганизмов, или культивирование, происходит в специальных аппаратах, так называемых биореакторах.

Биореактор, ферментер или ферментатор - это закрытая или открыта емкость, в которой при определенных условиях (давление, температура, концентрация сухих веществ, рН среды и т.д.) протекает на клеточном или молекулярном уровне контролируемая реакция, осуществляемая с помощью микроорганизмов.

Этап роста культуры включает несколько фаз:

а) лаг-фазу - сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объеме биореактора;

б) экспоненциальную фазу - бурное деление клеток, сбалансированный рост культуры;

в) фазу замедленного роста, связанного с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма;

г) стационарную фазу - прирост клеток равен их убыли; д) фазу отмирания - постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.

Биотехнологически ценные продукты синтезируются в экспоненциальную фазу (нуклеотиды, многие ферменты, витамины - так называемые первичные метаболиты) или в стационарную фазу роста (антибиотики, красящие вещества и т.д. - так называемые вторичные метаболиты или идиолиты).

Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой: помимо внесения питательного субстрата в реактор до введения в него биообъекта, в процессе культивирования в аппарат добавляют питательные вещества через определенные промежутки времени порциями или непрерывно «по каплям». Иногда дополнительно вносят биообъект.

Существует также отьемнодоливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды. Это приводит к регулярному омолаживанию культуры и к задержке ее перехода к фазе отмирания. Такой режим культивирования в значительной мере уподобляется непрерывному процессу, поэтому называется также полунепрерывным культивированием.

В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей питательной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.

Выделяют два основных способа культивирования микроорганизмов.

Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов

Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде. Он технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается механизации и автоматизации.

Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, а с другой - составляет наибольшую техническую трудность, т.к. нарушение асептики часто приводит к прекращению образования целевого продукта.

Концентрация целевого продукта в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Фильтраты культуральных жидкостей содержат не более 3% сухих веществ. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтратов перед тем, как выделять полученные продукты любым методом.

Поверхностный метод культивирования микроорганизмов-продуцентов

Культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и используют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспечения кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с небольшой высотой слоя.

Недостатком метода является необходимость больших площадей для выращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в неасептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерилизованы. Перед новой загрузкой должны дезинфицироваться растительные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь.

Главное преимущество поверхностного метода - более высокая конечная концентрация целевого продукта на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культуры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и легко высушить, их легко перевести в товарную форму и транспортировать. Меньше потребность электроэнергии по сравнению с глубинным методом.

Требования микроорганизмов к питательным веществам

Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями. Основными биогенными элементами являются углерод, азот, фосфор, кислород, водород, сера. Это компоненты белков, углеводов и жиров, а также нуклеиновых кислот. Эти элементы требуются в значительных количествах (г/л) и поэтому их называют макроэлементами.

К макроэлементам также относятся ионы калия, магния, натрия, кальция и железа. Они выполняют в клетке разнообразные функции. Например, К⁺ необходим для активности большого числа ферментов и в частности, ферментов белкового синтеза. Са²⁺ определяет устойчивость бактериальных эндоспор к нагреванию. Mg²⁺ стабилизирует рибосомы, многие ферменты и клеточные мембраны. Fe²⁺ и Fe³⁺ являются частью цитохромов и кофакторами электронпереносящих белков.

Микроэлементы, необходимые в микромолярных количествах, - это ионы таких металлов, как хром, кобальт, медь, молибден, марганец, никель, селен, вольфрам, ванадий, цинк, обычно входящие в состав ферментов и кофакторов. Например, Со²⁺ является компонентом витамина В₁₂, Cu²⁺ входит в состав цитохромоксидазы и купредоксинов, Mn²⁺ активирует ферменты, катализирующие перенос фосфатных групп, Мо²⁺ входит в состав нитрогеназы и нитратредуктазы, Ni²⁺ является компонентом уреазы, гидрогеназы, кофактора F₄₃₀, Zn²⁺ входит в состав карбоангидразы, ДНК- и РНК-полимераз и т.д. Необходимые для микроорганизмов количества микроэлементов содержатся в обычной водопроводной воде. При работе на дистиллированной воде микроэлементы добавляют специально в виде растворов их минеральных солей.

Биогенные элементы должны присутствовать в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Как правило, ионы металлов, сера, фосфор и микроэлементы добавляют в среду в виде минеральных солей. Минеральная основа среды (минеральный фон) практически одинакова для большинства микроорганизмов.

Источники углерода и азота в среде могут быть как неорганическими соединениями (СО₂, N₂, карбонаты, нитриты, нитраты, аммонийные соли), так и органическими веществами разной степени сложности и окисленности (сахара, спирты, органические кислоты и аминокислоты, олигосахариды, пептиды и т.д.). Если микроорганизму требуется набор источников углерода или азота, и тогда применяют различные экстракты и гидролизаты смеси белков и полисахаридов неопределенного состава (сусло, гидролизат молочного белка, пептон и др.).

У некоторых микроорганизмов спектр потребляемых органических веществ очень широк (например, у Pseudomonas, Actinomyces), у других – достаточно узок (например, у облигатных метилотрофов). В то же время, можно найти микроорганизмы, способные использовать сложные неприродные соединения типа пластиков, красителей, пестицидов. У некоторых микроорганизмов потребности в питании так сложны, что они растут только внутри живого организма (например, внутриклеточные паразиты риккетсии и хламидии).