Оценка качества ферментного препарата
Определение амилолитической активности(АС). Метод основан на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы. АС характеризует способность амилолитических ферментов катализировать гидролиз крахмала до декстринов и выражается числом единиц указанных ферментов в 1 г препарата.
За единицу амилолитической активности принято такое количество ферментов, которое в строго определенных условиях (температура, pH, продолжительность действия) расщепляет на 30% до декстринов различной молекулярной массы 1 г растворимого крахмала.
Для приготовления основного раствора ферментного препарата берут 0,1 г исследуемого ферментного препарата, растворяют в колбе на 100 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой, раствор перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Основной раствор ферментного препарата можно хранить не более суток при температуре от +2 до -4°С.
Рабочий раствор ферментного препарата готовят из основного раствора таким образом, чтобы в 5 см3 этого раствора содержалось такое количество фермента, под действием которого гидролизуется 20-70% крахмала. Для этого берут различное количество основного
раствора (в зависимости от активности анализируемого препарата) и разбавляют водой до 50 см3 при анализе препарата активностью от 20 до 700 ед./г и до 200 см3 при активности более 700 ед./г.
Необходимое количество основного раствора, которое следует взять для приготовления рабочего раствора фермента, определяют в соответствии с таблицей 38.
Таблица 38
| Предполагаемая амилолитическая активность (АС) 1 г препарата | Количество препарата в 5 см3 рабочего раствора, мг | Количество основного раствора, необходимое для вторичного разбавления, см3 | Общий объем разбавленного раствора, см3 |
| 25-80 | |||
| 80-150 | |||
| 150-300 | |||
| 300-700 | 0,5 | ||
| 700-1200 | 0,25 | ||
| 1200-2500 | 0,125 | ||
| 2500-5000 | 0,05 | ||
| 5000 и выше | 0,025 |
Для приготовления 1%-ного раствора крахмала (субстрата) берут 1 г крахмала (в пересчете на сухое вещество), помещают в мерную колбу на 100 см3, приливают 25 см3 воды, перемешивают, добавляют еще 25 см3 воды и нагревают в кипящей водяной бане до полного растворения крахмала. Затем содержимое колбы охлаждают, добавляют 10 см3 ацетатного буферного раствора с pH 4,7 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой,
Приготовление растворов йода.Для приготовления основного раствора 0,5 г йода и 5 г йодида калия растворяют в бюксе с притертой крышкой в малом количестве воды, содержимое переносят в мерную колбу на 200 см3 и доводят до метки дистиллированной водой. Основной раствор йода хранят в темноте и используют в течение 1 мес.
Для приготовления рабочего раствора йода 2 см3 основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки 0,1 н раствором соляной кислоты. Перед началом использования этого раствора на фотоэлектроколориметре измеряют оптическую плотность при длине волны 453 нм в кюветах 1 см. Она должна быть 0,22. Если отличается, то к раствору добавляют несколько капель основного раствора йода иди кислоты.
Приготовление растворов из культуры гриба.Для приготовления основного раствора (вытяжки) 5 г исследуемой культуры гриба переносят в коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 90 см3 дистиллированной воды и 10 см3 ацетатного буферного раствора с pH 4,7. Смесь термостатируют при помешивании 1 ч при 30°С и фильтруют. Фильтрат используют в качестве основного раствора.
Таблица 39
| Предполагаемая АС культуры гриба, ед/г | Количество культуры в 5 см3 рабочего раствора, мг | Количество основного раствора, необходимое для вторичного разбавления, см3 | Общий объем разбавленного раствора, см3 |
| 5-15 | 37,5 | ||
| 16-50 | |||
| 51-100 | 2,5 | ||
| 101-150 | 1,25 | ||
| 151-300 | 0,625 | 0,5 |
Рабочий раствор готовят из основного в соответствии с данными, приведенными в таблице 39.
Техника определения.В две пробирки (диаметр 20 и высота 180 мм) наливают по 10 см3 1%-ного раствора крахмала и ставят в термостат при температуре 30°С. Не вынимая пробирок, в них добавляют - в одну 5 см3 дистиллированной воды (контрольная), в другую - 5см3 ферментного раствора (опытная). Содержимое в колбах перемешивают, выдерживают в термостате точно 10 мин, отбирают по 0,5 см3 растворов, переносят их в колбы с предварительно налитыми туда по 50 см3 рабочего раствора йода и перемешивают. При этом контрольный раствор окрашивается в синий цвет, а опытный - в фиолетовый различной интенсивности в зависимости от количества непрогидролизовавшего крахмала.
В полученных растворах определяют оптическую плотность при длине волны 656 нм в кюветах 1 см. Для элиминирования (устранения) растворителя используют дистиллированную воду.
Оптическая плотность контрольного раствора D, соответствует количеству исходного крахмала субстрата, а оптическая плотность опытного раствора D, соответствует количеству крахмала, оставшегося после действия фермента. Разность оптической плотности контрольного и опытного растворов соответствует количеству прогидролизовавшего крахмала субстрата.
Количество прогидролизовавшего крахмала (С, г) определяют по формуле
где
0,1-количество крахмала, взятое для испытания в качестве субстрата, г.
Если количество прогидролизовавшего крахмала меньше 0,02 или больше 0,07, то анализ повторяют. Для этого при приготовлении рабочего раствора фермента берут большее или меньшее количество исходного раствора для разбавления.
Амилолитическую активность АС (ед-/г) препаратов бактериального происхождения вычисляют по формуле АС = (5,885 С + 0,001671) 1000/п, а амилолитическую активность препаратов грибного происхождения - по формуле АС,= (7,264 С - 0,03766) 100/п, где: 1000 и 100 - коэффициенты пересчета мг в г, я - количество ферментного препарата, взятого для анализа, мг.