Окислительно-восстановительные ферменты
Клеточное дыхание.Дыхание и связанный с ним ферментативный распад углеводов — важнейший источник энергии, и многочисленных промежуточных продуктов, которые клетка использует в различных метаболистических процессах.
Различают аэробное дыхание, протекающее в присутствии кислорода, и анаэробное, не требующее кислорода (брожение).
Суммарное уравнение аэробного дыхания:
С6Н12О6 + 6О2 6СО2 + 6Н2О + 2870 кДж
Гексоза
Анаэробное дыхание может протекать по трем основным типам:
Спиртовое брожение:С6Н12О6 2С2Н5ОН + 234 кДж
Гексоза Этанол
Молочнокислое брожение:С6Н12О6 2СН3СНОНСООН
Гексоза Молочная кислота
Молочнокислое брожение:С6Н12О6 СН3СН2СН2СООН + 2СО2 + 2Н2
Гексоза Масляная кислота
Приведенные реакции не отражают всей сложности многочисленных ферментативных реакций, осуществляемых комплексом ферментов, главным образом, оксидоредуктазами и лиазами.
Взаимосвязь двух типов дыхания обусловлена общим первым этапом, в процессе которого глюкоза ферментативным путем превращается в пировиноградную кислоту — СН3СОСООН (гликолиз), затем пути расходятся: в аэробных условиях пировиноградная кислота окисляется до уксусной кислоты, которая под действием кофермента А, переходит в активированную форму ацетил КоА, последняя включается в цикл Кребса, где полностью окисляется до СО2 и Н2О с выделением большого количества энергии. В анаэробных условиях пировиноградная кислота превращается в ацетоальдегид и СО2; ацетоальдегид, в свою очередь, может переходить в этанол (спиртовое брожение).
В качестве дыхательного материала в растениях кроме углеводов могут использоваться жиры (например, при прорастании семян масличных культур), белки и аминокислоты (например, при прорастании семян бобовых культур), органические кислоты (например, в листьях и побегах суккулентных растений).
В зависимости от преимущественного использования тех или иных веществ, в процессе дыхания изменяется величина дыхательного коэффициента[1]. При аэробном распаде гексоз дыхательный коэффициент равен 1, а при распаде яблочной кислоты (при аэробном дыхании в плодах) — 1,33.
Интенсивность дыхания зависит от температуры и влажности сырья. Снижение этих параметров уменьшает интенсивность дыхания и увеличивает срок хранения сырья.
Полифенолоксидаза (Н.Ф. 1.14.18.1). Этот фермент известен под различными тривиальными названиями: о-дифенолоксидаза, тирозиназа, фенолаза, катехолаза и др. Фермент может катализировать окисление моно-, ди-, и полифенолов.
Молекула фермента обладает четвертичной структурой и имеет молекулярную массу около 34000 Да. Полифенолоксидаза — купропротеид, содержит один атом Cu на молекулу фермента. Зона оптимальной активности лежит между рН 5,0–7,0. В зависимости от того из какого источника выделен фермент, способность его к окислению различных фенолов различна. Более того, даже в одном и том же объекте полифенолоксидаза может содержаться в виде различных молекулярных форм, отличающихся по способности к окислению различных фенолов.
С действием этого фермента связано образование темноокрашенных соединений — меланинов при окислении кислородом воздуха аминокислоты тирозина. Потемнение срезов картофеля, яблок, грибов, персиков и других растительных тканей в большей степени или полностью зависит от действия полифенолоксидазы. В пищевой промышленности основной интерес к этому ферменту сосредоточен на предотвращении, рассмотренного нами, ферментативного потемнения, которое имеет место при сушке плодов и овощей, а также при производстве макаронных изделий из муки с повышенной активностью полифенолоксидазы. Эта цель может быть достигнута путем тепловой инактивации фермента (бланшировка), добавлением ингибиторов (NaHSO3, SO2, NaCl) или связыванием субстрата посредством метилирования.
Положительная роль фермента проявляется при некоторых фермен-тативных процессах: например, при ферментации чая. Окисление дубильных веществ чая под действием полифенолоксидазы приводит к образованию темноокрашенных и ароматических соединений, которые определяют цвет и аромат черного чая.
Каталаза (Н.Ф. 1.11.1.6). Этот фермент катализирует разложение пероксида водорода на кислород и воду.
Каталаза относится к группе гемопротеиновых ферментов, содержит 4-е атома железа в виде геминовой группировки на одну молекулу фермента. Молекулярная масса ферментов, выделенных из различных объектов (дрожжей, растительных и животных тканей, микроорганизмов), лежит в пределах от 225000 до 250000 Да. Они имеют существенные различия в оптимуме рН (от 2 до 9), в термо- и рН-стабильности. Фермент ингибируется цианидом (обратимо), фенолами (обратимо лишь в слабой форме), щелочью и мочевиной (необратимо). Функцией каталазы в живом организме является защита клетки от губительного действия перекиси водорода.
Хорошим источником для получения промышленных препаратов каталазы являются культуры микроорганизмов и печень крупного рогатого скота. Каталаза находит свое применение в пищевой промышленности при удалении избытка Н2О2 при обработке молока в сыроделии, где последняя используется в качестве консерванта; а также совместно с глюкозооксидазой применяется для удаления кислорода и следов глюкозы.
Пероксидаза (Н.Ф. 1.11.1.7). Пероксидазы — ферменты, катализирующие реакции окисления различных веществ пероксидом водорода. Пероксидаза — двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание гема и гликопротеида. Показано, что углеводная часть придает белку большую специфичность; предполагают, что углеводы стабилизируют трехмерную структуру фермента.
В настоящее время выделено и охарактеризовано большое число множественных форм фермента, и доказано существование изоферментов, т.е. тех форм ферментов, которые обусловлены генетически. В связи с этим, принято говорить о целой системе пероксидаз, работающей в любом живом организме. Интересным представляется факт широкой субстратной специфичности пероксидаз по отношению к донорам водорода (1-ый субстрат), ими могут служить фенолы, амины, другие органические соединения; и строгой специфичности по отношению к акцептору водорода (2-ой субстрат) — перекиси водорода.
Изучению пероксидазы были посвящены классические работы Г. Теореля, Б. Чанса, А. Н. Баха, Р. Шода. Наиболее активная пероксидаза выделена из корней хрена. Ее молекулярная масса равна примерно 40000 Да, изоэлектрическая точка 7,2. Фермент содержит один атом железа на молекулу. Он достаточно устойчив в растворах при величинах рН от 4 до 12; его термостабольность значительно выше термостабильности каталазы. Оптимум рН для пероксидазы хрена равен 7; при рН от 6 до 8 сохраняется 70% его активности.
Липоксигеназа (Н.Ф. 1.13.11.12). Этот фермент катализирует окисление полиненасыщенных высокомолекулярных жирных кислот (линолевой и линоленовой) кислородом воздуха с образованием гидроперекисей, обладающих сильными окислительными свойствами, и именно на этом основано использование липоксигеназы в пищевой промышленности.
Липоксигеназа впервые была выделена из семян сои в 1928 году. Последующие исследования показали, что липоксигеназа широко распространена и в других растительных объектах: пшенице и других злаках, в семенах масличных и бобовых культур, в картофеле, баклажанах и т.д.
Тем не менее, самым богатым источником фермента является мука соевых бобов. Липоксигеназа, полученная в кристаллическом состоянии из семян сои, имеет молекулярную массу 102000 Да, изоэлектрическую точку 5,4. Оптимумы рН для ферментов, выделенных из различных объектов, сильно различаются. Оптимум температуры липоксигеназы находится между 20 и 300С.
В зерне пшеницы активность липоксигеназы колеблется в значительных пределах и является сортовым признаком. Кроме того, активность липоксигеназы связана с показателем жизнеспособности зерна. Она закономерно снижается со снижением всхожести зерна и может быть биохимическим тестом жизнеспособности семян. Значительная часть липоксигеназы пшеницы прочно связана с клейковинными белками и освобождается при обработке клейковинного комплекса раствором восстановленного глютатиона.
Липоксигеназе принадлежит важная роль в процессах созревания пшеничной муки, связанных с улучшением ее хлебопекарных достоинств. Образующиеся под действием фермента продукты окисления жирных кислот способны вызывать сопряженное окисление ряда других компонентов муки (пигментов, SH-групп клейковинных белков, ферментов и др.). При этом происходит осветление муки, укрепление клейковины, снижение активности протеолитических ферментов и другие положительные изменения.
В разных странах разработаны и запатентованы способы улучшения качества хлеба, основанные на использовании препаратов липоксигеназы (главным образом, липоксигеназы соевой муки). Все они требуют очень точного дозирования фермента, так как даже небольшая передозировка приводит к резко отрицательному эффекту и вместо улучшения качества хлеба происходит его ухудшение.
Более мягкий способ воздействия на компоненты муки и теста связан с активацией собственной липоксигеназы муки путем некоторого варьирования технологическим процессом. При этом исключается эффект передозировки фермента со всем комплексом нежелательных последствий.
Использование липоксигеназы как улучшителя окислительного действия требует определенной осторожности, т.к. хорошо известна токсичность переокисленных жиров. Интенсивное окисление липоксигеназой свободных жирных кислот может сопровождаться вторичными процессами образования веществ различной химической природы с неприяным вкусом и запахом, характерным для прогорклого продукта. Технологически приемлема ограниченная степень окисления полиненасыщенных жирных кислот как промежуточного звена преобразования других компонентов биологического материала, не приводящая к накоплению фракции окисленных липидов.
Глюкозооксидаза (Н.Ф. 1.1.3.4).Этот фермент был впервые выделен еще в 1904 году Н. А. Максимовым из плесневых грибов. Фермент представляет собой флавопротеид, в котором белок соединен с двумя молекулами ФАД. Он окисляет глюкозу с образованием в конечном счете глюконовой кислоты и обладает практически абсолютной специфичностью по отношению к глюкозе. Высокоочищенные препараты глюкозооксидазы получают из плесневых грибов рода Аspergillus и Penicillium. Они имеют примерно одинаковый молекулярную массу около 150000 Да, изоэлектрическую точку 4,2–4,3 и оптимум рН 5,6.
В последние годы глюкозооксидаза получила широкое применение. Благодаря исключительной специфичности препараты глюкозооксидазы применяются как аналитическое средство для количественного определения глюкозы. Кроме этого, препараты глюкозооксидазы нашли применение в пищевой промышленности, как для удаления следов глюкозы, так и для удаления следов кислорода. Первое — необходимо при обработке пищевых продуктов, качество и аромат которых ухудшаются из-за того, что в них содержатся восстанавливающие сахара; например, при получении из яиц сухого яичного порошка. Здесь имеется в виду реакция Майяра, так как глюкоза при сушке и хранении яичного порошка, особенно при повышенной температуре, легко вступает в реакцию с аминными группами аминокислот и белков. Порошок темнеет и образуется ряд веществ с неприятным вкусом и запахом. Второе — необходимо при обработке продуктов, в которых длительное присутствие небольших количеств кислорода приводит к изменению аромата и цвета (пиво, вино, фруктовые соки, майонез). Внесение пакетиков, содержащих смесь воды, глюкозы, фермента и буфера, способствует удалению кислорода из воздушного пространства. Во всех подобных случаях в ферментную систему включают каталазу, разлагающую Н2О2, которая образуется при реакции глюкозы с кислородом. Этот метод нашел широкое применение для удаления кислорода из банок с сухим молочным порошком.
Гидролитические ферменты
Роль ферментов класса гидролаз в пищевых технологиях очень велика. Это находит отражение в специальной литературе, монографиях, технических инструкциях, стандартах. Поэтому в этом разделе остановимся на краткой характеристике наиболее важных представителей гидролитических ферментов. Для технологов наибольший интерес представляют три подкласса ферментов класса гидролаз. Это ферменты, действующие на сложноэфирные связи — эстеразы (Н.Ф. 3.1); действующие на гликозидные соединения — гликозидазы (Н.Ф. 3.2) и действующие на пептидные связи — протеазы (Н.Ф. 3.4).
Эстеразы (Н.Ф. 3.1).Этот подкласс включает большое число ферментов (около 150), которые разделены на семь подподклассов. Наиболее важными с точки зрения участия в различных биохимических процессах, имеющих место при хранении и переработке пищевого сырья, являются ферменты подподкласса 3.1.1 — ферменты, действующие на эфиры карбоновых кислот.
Липаза (Н.Ф. 3.1.1.3).Липаза, или триацилглицерол-липаза, широко распространена в природе и играет важную роль в процессах, протекающих при переработке и хранении пищевых продуктов. В настоящее время выделены и охарактеризованы липазы растительного (липаза клейщивины, пшеницы и других злаков); животного (панкреатическая липаза, липаза молока) и микробного (бактериальные и грибные липазы) происхождения. Обычно липазы катализируют реакцию расщепления триглицеридов на глицеринсмесь жирных кислот. Многочисленные экспериментальные данные дают основание предположить следующий путь липолиза:
Триглицерид 1,2-Диглицерид 2-Моноглицерид Глицерин
Установлено, что липазы быстрее отщепляют остатки высокомолекулярных жирных кислот, чем низшие карбоновые кислоты. Ферментативный гидролиз липидов имеет существенное отличие от других гидролитических реакций. Парадокс заключается в том, что липаза — водорастворимый фермент, а ее субстрат гидрофобен; однако, активность липазы возрастает на границе «вода – липид». Этот феномен известен под названием «межфазная активация».
Липазы различного происхождения сильно отличаются друг от друга по специфичности действия, сродству к различным субстратам, растворимости, оптимуму рН и другим свойствам. Так, например, липаза семян клещевины нерастворима в воде, имеет оптимум рН 4,7–5,0; панкреатическая липаза растворима и оптимум рН ее действия лежит в слабощелочной среде. Липазы микробного происхождения и липаза пшеничных зародышей также отличаются от липазы клещевины. Они растворимы в воде и имеют рН оптимум при 8,0. Липаза молока, молекулярная масса которой примерно 7000 Да, имеет оптимум рН 9,0–9,2 при гидролизе молочного жира.
Зерновая липаза участвует в процессе порчи зерновых продуктов при хранении. Особенно это касается продуктов, содержащих повышенное количество жира, например, овсяной муки или крупы, пшена. Накопление свободных жирных кислот под действием липазы (рост кислотного числа жира) — признак ухудшения качества продукта. Свободные жирные кислоты, особенно ненасыщенные, легко подвергаются окислению под воздействием разных факторов: липоксигеназы, тепловой обработки, кислорода воздуха, солнечного света и др. Таким образом, липазы могут инициировать процесс прогоркания и ограничивать сроки хранения пищевых продуктов.
Одна из особенностей липаз связана с тем, что эти ферменты способны катализировать и обратную реакцию, осуществлять синтез сложных эфиров, а также производить переэтерефикацию триглицеридов, т.е. изменять их жирнокислотный состав. На этом основании разрабатываются способы получения новых форм жировых продуктов с использованием специфических липаз.
Пектинэстераза (Н.Ф. 3.1.1.11). Пектинэстеразы синтезируются высшими растениями, микроскопическими грибами, дрожжами, и бактериями.Пектинэстераза катализирует гидролиз сложноэфирных связей в молекуле растворимого пектина, отщепляя метоксильные группы, в результате чего образуется метиловый спирт и полигалактуроновая кислота.
Желирующая способность пектина зависит от степени метоксилирования или степени этерификации, поэтому действие пектинэстеразы по отщеплению метоксильных групп приводит к снижению желирующей способности и сопровождается падением вязкости. На этом, очевидно, и основывается применение этого фермента для осветления плодовых соков и вина. Обычно комплексные препараты пектолитических ферментов, применяемые для этих целей, получают из различных плесневых грибов, и прежде всего из A. niger.
Гидролазы гликозидов, или гликозидазы, (Н.Ф. 3.2).Этот подкласс включает около ста ферментов с разной специфичностью действия, осуществляющих гидролиз олиго- и полисахаридов; некоторые ферменты этого типа способны осуществлять трансферазные реакции — переносить гликозидные остатки на олиго- и полисахариды, наращивать полисахаридные цепочки. Основной формой запасных углеводов в семенах и клубнях растений является крахмал. Ферментативные превращения крахмала лежат в основе многих пищевых технологий. Поэтому ферменты амилолитического комплекса растительного, животного и микробного происхождения интенсивно изучаются со времени их открытия К. С. Кирхгофом в 1814 году и до настоящего времени.
α-Амилаза (Н.Ф. 3.2.1.1).α-Амилазы обнаружены у животных (в слюне и поджелудочной железе), в растениях (проросшее зерно пшеницы, ржи, ячменя), они вырабатываются микромицетами и бактериями. Все эти ферменты гидролизуют крахмал, гликоген и родственные α-1,4-глюканы с образованием, главным образом, декстринов и небольшого количества дисахарида мальтозы.
Скорость, с которой α-амилазы гидролизуют глюканы различной степени полимеризации, быстро уменьшается по мере ее снижения. Амилоза — линейная фракция крахмала, гидролизуется быстрее, чем амилопектин, имеющий разветвленную структуру. Скорость гидролиза α-амилазой зависит от вида и состояния крахмала (нативный или клейстеризованный крахмал), а также от эффективности самих амилаз. На основании параллельно проводившихся опытов (в одних — действовали препаратами амилаз на клейстеризованный крахмал, а в других — эквивалентными концентрациями на нативные крахмальные зерна) было показано, что эффективность амилаз различного происхождения уменьшается в следующем порядке: панкреатическая, солодовая, бактериальная, грибная.
Характерной особенностью всех α-амилаз является наличие одного атома Са на молекулу фермента. Роль кальция состоит в том, что он стабилизирует вторичную и третичную структуру молекулы α-амилазы, обеспечивая, таким образом, ее каталитическую активность и вместе с тем предохраняя фермент от действия протеолитических ферментов и тепловой денатурации.
Различные α-амилазы отличаются по молекулярной массе, устойчивости к нагреванию и некоторым другим показателям. Молекулярная масса α-амилаз близка к 50000 Да, за исключением бактериальной α-амилазы, которая имеет молекулярную массу 96900 Да (кристаллический препарат). Так, например, широко применяемая в промышленности α-амилаза из плесневого гриба А. oryzae, полученная в кристаллическом виде, имеет молекулярную массу 51860 Да.
Большое практическое значение имеет влияние температуры и рН на стабильность амилаз. Быстрое разрушение зерновой α-амилазы при рН 3,3–4,0, например, дает возможность выпекать ржаной хлеб из муки, которая содержит избыток α-амилазы, при низких значениях рН, чтобы предотвратить излишнее декстринирование крахмала и образование клейких веществ в мякише хлеба.
Говоря о термостабильности α-амилаз различного происхождения, можно расположить их в следующем ряду по мере снижения устойчивости к нагреванию: бактериальные амилазы – зерновые амилазы – грибные амилазы.
Последними работами в области изучения амилаз показано, что в семенах растений присутствуют два типа α-амилазы: α-амилаза созревания и α-амилаза прорастания.
В созревающем зерне синтезируется α-амилаза созревания, которая затем переходит в латентную форму, локализуясь на мембранах алейронового слоя. Первый этап гидролиза крахмала при прорастании осуществляется этой α-амилазой. И только на следующем этапе в работу включается вновь синтезируемый фермент — α-амилаза прорастания. Ее синтез в клетках зародыша и алейронового слоя начинается при влажности зерна выше 28%. Две формы α-амилазы семян злаков различаются по термостабильности: α-амилаза созревания при 700С теряет 50% своей активности, тогда как α-амилаза прорастания при этой температуре только незначительно снижает свою активность.
Интенсивность гидролиза крахмала в перерабатываемом сырье, как уже отмечалось ранее, определяется взаимодействием многих факторов. Это прежде всего состояние амилаз созревшего зерна и возможность перехода части латентной формы в свободное состояние. Это и состояние субстрата, его доступность действию фермента (атакуемость субстрата). Большое значение имеет и фракционный состав крахмальных гранул, соотношение мелких и крупных зерен, а также содержание поврежденных зерен крахмала, которые легче поддаются действию ферментов.
Как было установлено в последнее время, важная роль в этом процессе принадлежит протеолитическим ферментам. Протеазы, осуществляя ограниченное расщепление белков, способствуют освобождению амилаз из связанного состояния, а также гидролизуют ту часть запасных белков, которая прочно связана с поверхностью крахмальных гранул, облегчая, тем самым доступ фермента к субстрату.
Мощным механизмом регуляции скорости расщепления крахмальных гранул является система белковых ингибиторов амилаз, широко представленных в растениях. Ингибиторы белковой природы избирательно взаимодействуют с амилазами и образуют неактивные комплексы «амилаза – ингибитор». Высокой активностью обладают ингибиторы амилаз картофельного сока. Из зерна пшеницы выделен ингибитор с двумя активными центрами. Один активный центр имеет сродство к протеазам и способен блокировать их действие. Другой активный центр имеет сродство к амилазам. Таким образом, один ингибитор белковой природы способен блокировать работу, как протеаз, так и амилаз. В образующемся надмолекулярном комплексе ингибитор выполняет своеобразную роль связывающего звена, подавляя активность ферментов разного механизма действия.
β-Амилаза (Н.Ф. 3.2.1.2).β-Амилаза отщепляет мальтозу от нередуцирующего конца цепи, разрывая гликозидные связи через одну. Название «β-амилаза» было выбрано для того, чтобы показать, что мальтоза образуется в β-аномерной форме. Это не означает, что в молекуле крахмала присутствуют β-связи, а указывает скорее на то, что происходит инверсия конфигурации, которая может иметь место в процессе ферментативного превращения вещества, содержащего асимметрический атом углерода. Такая инверсия была открыта П. Вальденом в 1893 году и поэтому названа вальденовской инверсией.
Таким образом, действуя упорядочено, β-амилаза последовательно отщепляет остатки мальтозы с нередуцирующего конца до тех пор, пока не встретится точка ветвления со связью α-1,6. При этом амилоза под действием β-амилазы расщепляется до мальтозы на 100%, а при действии β-амилазы на амилопектин помимо образующейся мальтозы остается нетронутой крупная, сильно разветвленная сердцевина, так называемый «конечный декстрин», т.к. фермент прекращает свое действие за 2–3 остатка глюкозы от точек ветвления.
β-Амилазы — это ферменты в основном растительного происхождения. Хорошо известными источниками являются зерно пшеницы, а также пшеничный и ячменный солод, соевые бобы, клубни картофеля.
В отличие от α-амилазы, β-амилаза менее термостабильна, но проявляет большую устойчивость к кислым значениям рН, сохраняя свою активность при рН 3,3. Это нашло свое отражение в способе разделения α- и β-амилаз солода, где оба фермента присутствуют одновременно.
Глюкоамилаза (Н.Ф. 3.2.1.3).Глюкоамилаза продуцируется различ-ными видами микроскопических грибов рода Aspergillus: A. oryzae, A. niger, A. awamory и некоторыми другими, например, Rhizopus delamar и Rhizopus niveus. Эти ферменты расщепляют как амилозу, так и амилопектин до глюкозы, последовательно действуя с нередуцирующего конца цепи крахмала. Они способны гидролизовать α-1,4 и α-1,6 гликозидные связи.
Различные глюкоамилазы отличаются друг от друга скоростью гидролиза крахмала, отношением к температуре и рН и некоторыми другими показателями. На использовании препаратов грибной глюкоамилазы разработан ферментативный метод получения глюкозы.
β-Фруктофуранозидаза (Н.Ф. 3.2.1.26).Другие названия этого фермента — инвертаза, или сахараза. Для промышленного производства имеют значение только ферменты из S. cerevisiae и S. carlsbergensis. β-Фруктофура-нозидазу выделяют из дрожжей путем автолиза. В результате действия фермента на сахарозу получается смесь эквимолярных количеств α-глюкозы и β-фруктозы, получившая название «инвертного сахара». Термин «инверсия» обозначает изменения, происходящие в способности сахара вращать плоскость поляризованного света. Это можно выразить следующей схемой:
Сахароза + Н2О → D-Глюкоза + D-Фруктоза
[α]D = + 66,5o [α]D = + 52,5o [α]D = − 92,4o
Оптимум рН дрожжевой инвертазы находится в достаточно широкой зоне от 4,0 до 5,5. Фермент ингибируется ионами металлов. Полное ингибирование происходит под действием ртути и свинца; частичное ингибирование вызывают ионы серебра, цинка, меди. β-Фруктофуранозидаза гидролизует также рафинозу и метил-β-D-фруктофуранозид, причем, если относительную скорость гидролиза сахарозы принять за 100, то соответствующие скорости расщепления этих субстратов будут равны 47 и 77.
Инвертаза находит широкое применение в пищевой промышленности. Гидролиз концентрированных растворов сахарозы приводит к образованию более сладких сиропов. Точка кипения инвертированных сиропов выше, а точка замерзания ниже, т.к. при инверсии повышается осмотическое давление. Инвертаза применяется в кондитерской промышленности для производства отливных помадных корпусов конфет, круглых помадных корпусов и жидких фруктовых начинок, таких как вишневый ликер. В каждом случае ее применение обусловлено необходимостью получить полумягкую или жидкую консистенцию при высоких концентрациях сахара (78%), предотвращающих брожение.
β-Галактозидаза (Н.Ф. 3.2.1.23).Фермент, который часто называют лактазой, катализирует реакцию гидролитического отщепления нередуцирующих остатков β-D-галактозы в β-галактозидах, в частности, в молочном сахаре — дисахариде лактозе:
Ферментные препараты лактазы, применяемые в пищевой промышленности получают с помощью различных продуцентов: микроскопических грибов (A. oryzae, A. niger), бактерий (E.coli, Lactobacillus), дрожжей (S. fragilis, S. psedotropicalis). Все они имеют различные температурные оптимумы, которые, однако, лежат в пределах 370–500С. Оптимумы рН этих ферментов также заметно отличаются: для бактериальных около 7,0; для грибных около 5,0; для дрожжевой лактазы около 6,0.
При гидролизе лактозы в цельном молоке, обезжиренном молоке или в концентратах молока оптимальную активность (при нейтральном рН этих субстратов) проявляет дрожжевой фермент; для сыворотки и его концентратов — грибной. Причем в обезжиренном молоке или сыворотке лактоза гидролизуется легче, чем в цельном, а пастеризованные субстраты гидролизуются легче, чем непастеризованные.
β-Галактозидаза из E.coli была получена в кристаллическом состоянии, ее молекулярная масса 850000 Да. Она ингибируется некоторыми металлами (Cu, Zn). Восстанавливающие агенты (цистеин, сульфид Na, сульфит Na и др.) активируют фермент и способны преодолевать влияние ингибиторов-метал-лов.
Эндополигалактуроназа (Н.Ф. 3.2.1.15) и экзополигалактуроназа (Н.Ф. 3.2.1.67).Эти два фермента участвуют в превращениях пектиновых веществ наряду с другими пектолитическими ферментами растительного и микробного происхождения.
Эндополигалактуроназа — фермент, который гидролизует α-1,4-связи в молекуле растворимого пектина (метоксилированной полигалактуроновой кислоты), неупорядоченным, произвольным образом. С возрастанием степени этерификации полигалактуроновой кислоты, степень и скорость гидролиза падают, т.к. для проявления каталитической активности фермента, требуются свободные карбоксильные группы. Большинство изученных эндополигалактуроназ мироскопических грибов имеют молекулярную массу от 30000 до 40000 Да. Оптимальные значения рН колеблются в диапозоне 3,8–5,5.
В гидролизе этого типа связи принимает участие и другой фермент — экзополигалактуроназа, который последовательно отщепляет молекулу галактуроновой кислоты, начиная с нередуцирующего конца. Эндополигалактуроназа синтезируется как грибами, так и некоторыми видами бактерий. Они отличаются по своей специфичности к пектинам из различных источников, конечными продуктами реакции, оптимуму рН и другим свойствам.
Для промышленного производства ферментных препаратов пектолитических ферментов, которые являются комплексными, в качестве продуцентов используют в основном микроскопические (плесневые) грибы, в частности, грибы рода Aspergillus: A. niger, A. wentii, A. oryzae. Бактериальные ферменты в промышленных масштабах не производятся.
Растительные полигалактуроназы, по-видимому, похожи на грибные полигалактуроназы. Они обнаружены в широком спектре плодов и овощей: помидорах, авокадо, редисе, огурцах, яблоках, грушах, цитрусовых и др. Все они проявляют активность при естественных рН плодов.
Применение препаратов пектолитических ферментов в промышленности достаточно обширно. Они используются при производстве фруктовых соковых концентратов и экстрактов, при осветлении соков и вин, при производстве фруктовых и овощных пюре и нектаров.
Целлюлолитические ферменты. Ферментативное разрушение целлюлозы и родственных ей полисахаридов (гемицеллюлозы, лигнина) -- сложный процесс, требующий участия комплекса ферментов. Продуцентами такого комплекса целлюлолитических ферментов являются грибы рода Trichoderma, Phanerochaete (Sporotrichum) и Fusarium, а также бактерии рода Clostridium, Cellulomonas и некоторые другие.
Три основных типа целлюлолитических ферментов, продуцируемых микроскопическими грибами, образуют комплекс ферментов, способных осуществить полный гидролиз целлюлозы:
§ Эндо-1,4-β-глюканаза, или целлюлаза, (Н.Ф. 3.2.1.4)беспорядочно гидролизуетβ-1,4-гликозидные связи. Она не расщепляет целлобиозу, но гидролизует целлодекстрины и производные целлюлозы с высокой степенью замещения, т.к. специфичность этого фермента не высока.
§ Экзо-1,4-β-глюканаза, или целлобиогидролаза, (Н.Ф. 3.2.1.91) действует на целлюлозу, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего конца цепи. Этот фермент не действует на замещенные производные целлюлозы, что указывает на более высокую субстратную специфичность, чем у эндоглюконазы. Целлобиогидролаза гидролизует целлодекстрины, но не действует на целлобиозу.
§ β-глюкозидаза (Н.Ф. 3.2.1.21)расщепляет целлобиозу и целлооли-госахариды до глюкозы. Фермент не действует на целлюлозу и высшие олигосахариды.
Целлюлазная система бактерий существенно проще, чем у грибов, т.к. бактерии образуют только эндоглюканазу иβ-глюкозидазу.
Все ферменты целлюлолитического комплекса достаточно хорошо изучены: практически все они являются гликопротеидами, определены их молекулярные массы, изоэлектрические точки, для многих показано наличие множественных форм.
Доказано, что различные ферменты, гидролизующие высокоупорядоченную целлюлозу, действуют в синергизме. Эндоглюканаза атакует аморфные участки целлюлозных фибрилл. В результате образуются новые целлюлозные цепочки, на которые действует целлобиогидролаза, отщепляя целлобиозные звенья с нередуцирующего конца. Синергизм между двумя этими ферментами проявляется в том, что в результате действия эндоглюканазы появляется новый субстрат (более короткие цепочки), на который действует уже целлобиогидролаза. β-Глюкозидаза усиливает гидролиз, расщепляя целлобиозу — конечный продукт и ингибитор этих ферментов.
Применение целлюлолитических ферментов представляет большой интерес, т.к. ферментативный гидролиз целлюлозосодержащих материалов (древесина, торф, сельскохозяйственные и городские отходы) может обеспечить получение различных биотехнологических продуктов: глюкозы, этанола, ацетона, микробной биомассы.
Протеолитические ферменты (Н.Ф. 3.4).Основной реакцией, катализируемой протеолитическими ферментами, является гидролиз пептидной связи в молекулах белков и пептидов.
Протеазы разделяют на эндо- и экзопептидазы. Ферменты первой групп-пы — эндопептидазы могут гидролизовать глубинные пептидные связи, и расщеплять молекулу белка на более мелкие фрагменты; ферменты второй группы — экзопептидазы не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи и действуют либо с карбоксильного, либо с аминного конца цепи, отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты.
В связи с этимэкзопептидазыподразделяют на:
§ аминопептидазы (Н.Ф. 3.4.11), катализирующие отщепление N-кон-цевых аминокислот.
§ карбоксипептидазы (Н.Ф. 3.4.12), катализирующие отщепление С- концевых аминокислот.
§ дипептидазы (Н.Ф. 3.4.13), ферменты проявляющие специфичность к дипептидным субстратам.
Вместе с тем, эндопептидазы(протеиназы) разделены на подгруппы, начиная с подподкласса 3.4.21, в первую очередь, на основании каталитического механизма (строения активного центра); особенности специфичности используются при этом только для идентификации индивидуальных ферментов в пределах подподкласса.
§ сериновые протеиназы (Н.Ф. 3.4.21), в активном центре которых функционирует остаток серина и гистидина.
§ тиоловые (цистеиновые) протеиназы (Н.Ф. 3.4.22), содержат в активном центре SH-группу остатка цистеина.
§ кислые (карбоксильные) протеиназы (Н.Ф. 3.4.23), в активном центре содержат СООН-группу остатка аспарагиновой кислоты.
§ металлопротеиназы (Н.Ф. 3.4.24), содержат в активном центре металл, необходимый для проявления их каталитической активности.
Группа протеиназ о механизме действия которых ничего неизвестно отнесена к подподклассу 3.4.99.
Субстратная специфичность протеиназ будет определяться следующими факторами:
1. природой аминокислоты, образующей гидролизуемую пептидную связь,
2. радикалами аминокислот, удаленными от гидролизуемой пептидной связи,
3. общей пространственной конформацией молекулы белка, делающей определенные пептидные связи доступными для действия фермента.
Исследование протеолитических ферментов ведется весьма интенсивно. Это происходит вследствие того, что они являются чрезвычайно удобным объектом для изучения структуры белков, активных центров ферментов, механизмов регуляции ферментативной активности и других важных вопросов энзимологии, кроме того, протеазы широко применяются в различных отраслях промышленности: сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине. Остановимся на рассмотрении отдельных свойств протеаз, имеющих технологическое значен