Учебно-исследовательская работа студентов на занятии
1. Проделать лабораторную работу "Определение остаточного азота и билирубина в сыворотке крови".
2. Сделать выводы по результатам проведенных опытов. Оформить результаты опытов.
3. Подготовиться к защите лабораторной работы и решению задач (ориентировочные задачи и вопросы приведены ниже).
Лабораторная работа
I. Определение остаточного азота в сыворотке крови.
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. | ||
| 2. | Пипетки на 0,1мл,1 мл и 5 мл. | |||
| 3. | Колба на 50 или 100 мл. | |||
| 4. | Центрифуга. | |||
| 5. | Центрифужные пробирки. | |||
| Реактивы: | 1. | Реактив А. | ||
| 2. | Реактив В. | |||
| 3. | КI кристаллический. | |||
| 4. | НСl | |||
| 5. | 1% раствор крахмала | |||
| 6. | Сыворотка. | |||
| 7. | Дистиллированная вода. | |||
| 8. | 0,005 Н раствор тиосульфата натрия. | |||
Принцип метода. Остаточный азот – это небелковый азот биологических жидкостей. Гипобромитный метод его определения основан на свойстве гипобромита разрушаться при взаимодействие с азотистыми веществами безбелкового центрифугата. Остаток непрореагировавшего гипобромита определяют йодометрически – титрованием тиосульфатом натрия. Для расчета количества остаточного азота определяют количество разрушенного гипобромита, как разность между титром контрольной пробы (не содержащей остаточного азота) и опытной пробы (с остаточным азотом).
Ход работы. Для осаждения белков в пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки и 4,0 мл осаждающего реактива. Через 10 мин смесь центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. За это время готовят рабочий раствор гипобромита, смешивая 9 частей реактива А и 1 часть реактива В. В колбу для титрования отбирают 4 мл центрифугата, добавляют 5 мл рабочего раствора гипобромита, перемешивают и оставляют на 1-2 мин. Затем добавляют несколько кристалликов КI, 3 мл раствора НСl, смесь взбалтывают и титруют 0,005Н раствором тиосульфата до слабо-желтого цвета. Добавляют 2-3 капли раствора крахмала и дотитровывают до обесцвечивания. Одновременно с опытной готовят контрольную пробу, содержащую 4 мл осаждающего реактива, 5 мл рабочего раствора гипобромита, несколько кристалликов KI и 3 мл раствора HCI. Контрольную пробу титруют также до обесцвечивания.
Содержание остаточного азота рассчитывают по формуле:
(К - О) х 21,4 = ммоль/л, где К – количество тиосульфата, пошедшего на титрование контрольной пробы, О – на титрование опытной пробы, 21,4- коэффициент пересчета.
Нормальное содержание остаточного азота – 14,3 - 28,6 ммоль/л.
Диагностическое значение определения остаточного азота
Ретенционная (связанная с выведением) почечная гиперазотемия наблюдается при различных заболеваниях почек. Ретенционная непочечная гиперазотемия наблюдается при недостаточности кровообращения, травматическом шоке, опухолях мочевого пузыря.
Продукционная гиперазотемия сопровождается процессом усиления распада белка - при туберкулезе, диабете, тяжелом циррозе печени, при инфекционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадкой. Понижение остаточного азота наблюдается при недостаточном питании, иногда – при беременности.
2. Определение билирубина в сыворотке крови.
| Оборудование: | 1. | Штатив с пробирками. | |||
| 2. | Пипетки на 1 мл и 2 мл. | ||||
| 3. | КФК. | ||||
| 4. | Кюветы на 0,5 см. | ||||
| Реактивы: | 1. | Кофеиновый реактив. | |||
| 2. | 0,85% раствор NaCl. | ||||
| 3. | Диазореактив. | ||||
| 4. | Сыворотка крови. | ||||
Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит свободный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию свободного билирубина определяют как разность между общим и связанным билирубином.
Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме:
| Реактивы (мл) | Общий билирубин | Связанный билирубин | Контрольная проба |
| Сыворотка | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Кофеиновый реактив | 1,75 | ---- | 1,75 |
| 0,85% раствор NaCl | ---- | 1,75 | 0,25 |
| Диазореактив | 0,25 | 0,25 | ---- |
Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.
Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 мкмоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.
Диагностическое значение определения билирубина сыворотки крови
Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.
Заболевания, вызывающие повышение несвязанного билирубина: гемолитическая анемия, пернециозная анемия, желтуха новорожденных.