Реакция Селиванова на кетозы.
При нагревании фруктозы (и других кетогексоз) с соляной кислотой образуется оксиметилфурфурол, который с резорцином образует соединение, окрашенное в вишнево-красный цвет.
Альдозы также дают эту реакцию, но реакция у них протекает медленнее и в особых условиях (температура и кислотность среды).
В две пробирки наливают по 3 мл реактива Селиванова (0,05 г резорцина растворяют в 100 мл разбавленной (1:1) соляной кислоты), в одну из них добавляют 3 капли раствора фруктозы, в другую - 3 капли раствора глюкозы. Обе пробирки помещают в водяную баню, нагретую до 80ºС, и держат в ней 8 минут. За это время в пробирке с фруктозой появляется красное окрашивание.
Реакция Барфеда (отличие восстанавливающих дисахаридов от моносахаридов)
Проба Барфеда отличается тем, что окисление сахара протекает не в щелочной среде, а в среде, близкой к нейтральной. В этих условиях редуцирующие дисахариды в противоположность моносахаридам практически не окисляются, что позволяет отличить их от моносахаридов.
К 5 мл раствора Барфеда прибавляют 1 мл раствора исследуемого сахара. Смесь нагревают на водяной бане в течение 10 мин. Моносахариды восстанавливают реактив до оксида меди(I), дисахариды реакции не дают. Следует избегать длительного кипячения, так как дисахариды в кислой среде могут гидролизоваться до моносахаридов, и в результате реакция Барфеда станет положительной.
Приготовление реактива Барфеда.
13, 3 г ацетата меди растворяют в 200 мл горячей воды. Фильтруют и к фильтрату прибавляют 1,9 мл ледяной уксусной кислоты
Реакция крахмала и гликогена с иодом
К 2-3 мл раствора крахмала прибавляют 1-2 капли раствора Люголя. Раствор окрашивается в синий цвет. Содержимок пробирки делят на три части: к первой прибавляют 1-2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, ко второй — 2 мл этилового спирта; третью часть нагревают. Во всех случаях окраска исчезает, причем в третьей пробе окраска вновь появляется при охлаждении. Реакция основана на образовании нестойкого адсорбционного соединения иода с амилозой.
В пробирку наливают 2-3 мл раствора гликогена, добавляют 1-2 капли раствора Люголя, перемешивают, появляется красно-бурое окрашивание. Окраска усиливается при добавлении нескольких кристаллов хлорида натрия, но исчезает при добавлении раствора гидроксида натрия при нагревании.
Раствор Люголя готовят растворением 1 г иода и 2,5 г иодида калия в 20 мл воды. по растворении объем раствора доводят до 100 мл.
Микрохимическое определение сахаров путем окисления периодатом.
Аналитическая ценность иодной кислоты заключается в том, что она окисляет все вторичные карбинольные группы в молекуле сахара до муравьиной кислоты, которая определяется титрованием, а первичные карбинольные группы — формальдегида, который может быть связан димедоном:
СНO-(СНОН)4-СН2ОН + IO4 -- → 5 HCOOH + H2CO + 5 IO3-
Пентозы и метилпентозы образуют по 4 моль муравьиной кислоты, гексозы — по 5 моль, фруктоза и сорбоза — по 3 моль.
В пробирку с пришлифованной пробкой помещают около 3 мг сахара и растворяют его в 5 мл воды. К полученному раствору добавляют 1мл 0,25 М раствора периодата натрия.Смесь нагревают в течение 30 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения пробирки добавляют 0,2 мл этиленгликоля для разложения избытка периодата. Одновременно ставят контрольный опыт, в котором присутствуют все реагенты, кроме сахара. Раствор титруют 0,01 н раствором гидроксида натрия, применяя в качестве индикатора метиловый красный.
Качественные реакции на жиры.
Методы выделения жиров.
Обычно липиды извлекают из высушенных (обезвоженных) тканей соответствующими органическими растворителями (спирты, эфиры, бензол, толуол, бензин, ацетон, пиридин, хлороформ, четыреххлористый углерод, сероуглерод, петролейный эфир и др.). Для разделения липидов пользуются неодинаковой растворимостью их в различных растворителях: одни из них хорошо растворимы в эфире, но плохо в ацетоне (например, фосфолипиды), другие растворимы в бензоле, но не растворимы в спирте (холестерол, цереброзиды) и т.д. Резервный жир (масло) извлекается легко. Извлечь связанные липиды можно лишь после разрушения белково-липидных комплексов. Липиды из связанного состояния в свободное переводят либо путем применения гидролизующих средств, либо путем предварительного кипячения материала со спиртом. В последнем случае липиды выделяются в неизменном виде.
Наиболее простым методом определения суммарных липидов в тканях является метод длительного настаивания навесок ткани в хлороформ - метанольной смеси. По разности масс образца до и после экстракции находят процентное содержание липидов.
При выделении липидов из биологического материала происходит их окисление и деградация, приводящие к образованию побочных продуктов. Поэтому выделение липидов надо проводить быстро, в условиях, максимально исключающих влияние таких факторов, как повышенная температура, кислород воздуха, свет, загрязнение следами металлов и т.д.
Для экстракции используют смесь метанола и хлороформа, которая разрушает липопротеидные комплексы и тем самым дает возможность достаточно полно извлечь липиды.