Первичный сосудисто-тромбоцитарный гемостаз.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
НАРУШЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА
Учебное пособие
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ 3
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
МЕХАНИЗМ ГЕМОСТАЗА. СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ 4
Первичный сосудисто-тромбоцитарный гемостаз 4
Плазменный (коагуляционный) гемостаз 8
Коагуляционное звено гемостаза 9
Ингибиторы ферментов системы гемостаза (антикоагулянты) 14
Система фибринолиза 15
Лизис фибринового сгустка 6
Особенности гемостаза женщин при менструации и беременности 17
ПАТОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА 18
Гипокоагуляция. Геморрагические заболевания 19
Патология тромбоцитарного звена 19
Геморрагические коагулопатии 20
Гиперкоагуляция 23
Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) 27
Основные лекарственные препараты для лечения нарушений гемостаза 31
Принципы лечения кровоточивости 31
Медикаментозное лечение гиперкоагуляции 31
Ингибиторы функции тромбоцитов (антиагреганты) 31
Антикоагулянты прямого действия 32
Антикоагулянты непрямого действия (антагонисты витамина К) 34
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 36
Основные понятия 36
Основные этапы исследования гемостаза 37
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАЗА 43
Методы оценки общей коагуляции 43
Оценка сосудисто-тромбоцитарного звена 45
Оценка функционального состояния тромбоцитов 47
Тесты скриниговой коагулограммы 48
Протромбиновое время (ПВ). 48
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) 51
Тромбиновое время 53
Фибриноген 54
Дополнительные тесты 55
Оценка системы фибринолиза. Фибринолитическая активность 55
Оценка антикоагуляционного звена гемостаза 56
Антитромбин 56
Система протеина С 57
Оценка уровня тромбинемии 59
Доступные методы определения составляющих ПДФ 60
Выявление эффектов волчаночного антикоагулянта (ВА) 61
Основные скриниговые тесты 62
Лабораторная диагностика и мониторинг ДВС-синдрома 64
Суммарный средний индекс тромбогенности (ССИТ) 65
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 67
Библиография 68
ВВЕДЕНИЕ
Написание учебного пособия по гемостазу было продиктовано производственной необходимостью. Опыт общения с врачами клинической лабораторной диагностики, с врачами-клиницистами, с клиническими ординаторами и интернами показал, что система гемостаза вызывает наибольшее количество затруднений, связанных, в первую очередь, с интерпретацией результатов лабораторных исследований, а также с правильным выбором и проведением тестов.
В настоящее время ни одна лаборатория не обходится без хотя бы минимального набора тестов по гемостазу, так как нарушения свертывающей системы крови встречаются почти при всех видах патологии, а использование препаратов, влияющих на коагуляцию, вошло в практику большинства лечебных учреждений.
Существующие монографии по гемостазу, большое количество научной литературы полно и подробно описывают данную систему, однако они изобилуют большим количеством механизмов и схем и сложны для восприятия неподготовленного читателя.
Цель данного пособия - кратко в максимально доступной форме изложить механизмы гемостаза и дать основные подходы к диагностике нарушений свертывающей системы крови в пределах стандартной гемостазиограммы.
Настоящее пособие предназначено для начального изучения системы гемостаза и
рекомендуется для врачей клинической лабораторной диагностики, для врачей-клиницистов, для клинических ординаторов, интернов и студентов медицинских вузов.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
МЕХАНИЗМ ГЕМОСТАЗА.
СИСТЕМА ГЕМОСТАЗА. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ
Свертывающая система крови (гемостаз) является одной из самых сложных систем в организме. Это биологическая система, основной функцией которой является поддержание равновесия между антагонистически действующими механизмами, обеспечивающими сохранение жидкого состояния крови, предотвращение кровопотери путем поддержания целостности сосудистой стенки и образования тромбов в местах повреждения сосуда, растворение тромба и восстановление кровотока, обеспечение первичного заживления раны. Взаимодействие различных звеньев позволяет системе гемостаза удерживаться в пределах физиологических колебаний между гипокоагуляцией (снижением свертываемости крови) и гиперкоагуляцией (повышением свертываемости).
К структурным группам системы гемостаза относятся:
- интима кровеносных сосудов,
- клетки крови (тромбоциты, эритроциты, лейкоциты, макрофаги),
- плазменные ферментные системы крови.
В условиях жизни организма (in vivo) гемостаз является единой системой, все звенья которой тесно взаимосвязаны. Для удобства изучения система гемостаза условно разделена на две части: первичный сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и вторичный плазменно-ферментный коагуляционный гемостаз, состоящий из коагуляционного и фибринолитического звеньев.
В полисистему гемостаза также включены калликреин–кининовая система и система комплемента и иммунитета.
Процессы свертывания крови и фибринолиза в организме человека идут постоянно от рождения до смерти. Причиной может быть повреждение эндотелия, гибель клеток, выброс адреналина и др. Однако эти процессы имеют локальный характер. Генерализации процесса свертывания препятствует тесное взаимодействие звеньев гемостаза.Срыв механизмов адаптации приводит к генерализации процесса, который выражается развитием синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС).
Для остановки возникшего кровотечения необходима концентрация факторов свертывания крови в месте повреждения. Местом накопления факторов служат коллаген, тканевой фактор и фосфолипиды мембран тромбоцитов и некоторых других клеток.
Система фибринолиза.
В процессе образования гемостатической пробки активируются механизмы, направленные на ограничение роста тромба, его растворение и восстановление тока крови. Эти функции выполняет система фибринолиза, которая относится к одной из пяти протеолитических систем плазмы крови. Фибринолиз - основной эндогенный механизм, предотвращающий тромбообразование.
Ключевым ферментом системы фибринолиза является плазмин. В плазме крови он присутствует в виде неактивного профермента плазминогена, одноцепочечного гликопротеида, который синтезируется в печени, немного в почках, эозинофилах и роговице. Основная задача плазмина - растворять фибрин. Однако при высокой активности он может расщеплять фибриноген, некоторые факторы свертывания крови и компоненты системы комплемента. В физиологических условиях деятельность плазмина ограничена зоной тромбообразования. При патологических состояниях фибринолиз может быть генерализованным (гиперфибринолиз, активный фибринолиз, фибринолитическое состояние). В результате гиперфибринолиза накапливаются продукты деградации фибрина/фибриногена (ПДФ), клинически у пациента наблюдается кровотечение.
Уровень и активность плазмина в организме жестко регулируется и включает активаторы и ингибиторы фибринолиза. Их взаимодействие позволяет ограничить рост тромба и лизировать его. Фрагменты фибрина, образовавшиеся при лизисе сгустка, далее утилизируются лейкоцитами и макрофагами (клеточная составляющая фибринолиза).
Активация плазминогена, аналогично активации протромбина, осуществляется по внутреннему и внешнему пути.
Внутренний путь представляет контактную активацию, в которой участвуют указанные ранее факторы контактной активации: XII, XI, ВМК, ПК. К внутренним актваторам относится урокиназа (u-PA), которая синтезируется и выделяется клетками разных органов, в том числе почками, фибробластами, макрофагами и эндотелиальными клетками (ЭК).
Основной путь активации плазминогена – внешний под действием активатора плазминогена тканевого типа (t-PA, ТАП), поступающего из эндотелиальных клеток. Исследования показали, что главным стимулятором выделения ТАП является брадикинин, который образуется из ВМК при расщеплении его калликреином.
Нефизиологическими активаторами плазминогена могут быть стрептокиназа гемолитического стрептококка и ферменты других бактерий.
Плазмин в кровотоке быстро инактивируется естественными ингибиторами. Различают два вида ингибитров:
- антиплазмины (α2-антиплазмин, α2-макроглобулин, α1-антитрипсин и др.),
- ингибиторы активаторов плазминогена (PAI-1, PAI-2, PAI-3).
Основной ингибитор плазмина - α2-антиплазмин. Он синтезируется в печени и относится к ингибиторам сериновых протеаз.
Среди ингибиторов активаторов плазминогена наибольшее значение имеет PAI-1. Он ингибирует t-PA, u-PA и стрептокиназу. Продуцируется ЭК, клетками гладких мышц, мегакариоцитами и мезотелиальными клетками; депонируется в тромбоцитах. Синтез PAI-1 стимулируется эндотоксинами бактерий, провоспалительными цитокинами, тромбином и другими факторами, поэтому его уровень возрастает при многих патологических состояниях. Основная задача PAI-1 – ограничить фибринолиз местом тромба за счет ингибирования t-PA. Это легко выполняется за счет высокого содержания PAI-1 в сосудистой стенке.
Лизис фибринового сгустка.
Плазмин является активной, но достаточно неспецифичной сериновой протеазой. Хотя основная его функция – лизис фибрина, плазмин также хорошо расщепляет фибриноген, особенно при его высоком содержании, активации плазмина или недостатке его ингибиторов (рис.4).
При деградации фибрина и фибриногена образуются низкомолекулярные продукты, которые называются продуктами деградации фибрина/фибриногена (ПДФ) и являются вторичными антикоагулянтами. При деградации фибриногена его молекула расщепляется на D, Е и DЕ фрагменты. При расщеплении нерастворимого фибрина, имеющего поперечные изопептидные связи, образуются DD- фрагменты, которые называются Д-димерами. Таким образом, при наличии фибринового сгустка повышается уровень Д-димеров, что характерно для тромбозов и тромбэмболий, в том числе и тромбэмболии легочной артерии (ТЭЛА). Другие низкомолекулярные продукты образуют растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). Рост РФМК может наблюдаться при активации процессов свертывания крови, при высоком уровне фибриногена, при повышенном фибринолизе и фибриногенолизе и некоторых других состояниях. Уровень фибрин-мономера у здоровых людей и при большинстве видов патологии не повышается, так как он быстро полимеризуется или расщепляется. Увеличение фибрин-мономеров наблюдается практически только при ДВС-синдроме.
ПАТОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА
Исследования показали, что подавляющее большинство заболеваний сопровождается нарушениями в системе гемостаза. Патология гемостаза выражается либо гипокоагуляцией, либо гиперкоагуляцией, в ряде случаев смешанными нарушениями. Гипокоагуляция встречается сравнительно реже. Диагностика причин гипокоагуляции не всегда возможна в рамках стандартной, даже расширенной гемостазиограммы. Как правило, такие больные обследуются в специализированных лечебных учреждениях. Гиперкоагуляцией страдает большое число пациентов. Она проявляется у пациентов в виде тромбозов, тромбэмболий или тромбофилического состояния. Диагностика, лечение и контроль терапии, как правило, проводятся в лечебных учреждениях общего профиля.
Гиперкоагуляция.
Состояния, связанные с гиперкоагуляцией, встречаются часто, их диагностика и лечение в большинстве случаев проводится в рамках лечебных учреждений общего профиля.
Для пациентов данной группы характерно понятие тромбофилии – наклонности к тромбообразованию, повышению вязкости крови, агрегации тромбоцитов, снижению антикоагуляционного потенциала. Тромбофилия может приводить к развитию артериальных и венозных тромбозов и тромбэмболий.
Артериальные и внутрисердечные тромбозы, как правило, обусловлены изменением сосудистой стенки, например, при атеросклерозе, и активацией тромбоцитов. Артериальные тромбозы также могут быть связаны с наличием волчаночного антикоагулянта или со снижением уровня антикоагулянтов. Обычно это пристеночные белые тромбы, склонные к отрыву. Клинически артериальные тромбозы проявляются прекращением функции пораженного тромбозом органа, например, инфарктом миокарда или инсультом.
Появление венозных тромбозов связано с гиперкоагуляцией и стазом крови. Это чаще красные тромбы, полностью закрывающие просвет сосуда. Клинически венозный тромбоз проявляется в виде болевого синдрома с местным покраснением и повышением температуры.
Как при артериальном, так и при венозном тромбозе, особенно при тромбозе глубоких вен бедра, может быть отрыв тромба с последующей тромбэмболией легочной артерии (ТЭЛА), сосудов мозга (ишемический инсульт) и других мелких или крупных сосудов. Тромбэмболия при артериальных тромбозах может быть вызвана нарушением ритма сердечных сокращений, например, мерцательной аритмией.
Появление тромботических осложнений связывают как с наследственными, так и с приобретенными факторами.
Приобретенные факторы можно условно разделить на 2 группы: факторы, связанные с особенностями физиологии и образом жизни (возраст, пол, диета, курение, гиподинамия, повышенная масса тела, беременность), и вторичные нарушения, обусловленные другим заболеванием.
Классификация основных видов тромбофилий.
1. Гемореологические формы при миелопролиферативных заболеваниях, полиглобулиях, нарушениях объема и формы эритроцитов (гемоглобинопатии, ферментопатии и др.), при повышенной вязкости крови (парапротеинемии, гиперфибриногенемии, гаммапатии).
2. Формы, связанные с сосудисто-тромбоцитарным гемостазом: тромбоцитозы, повышенная агрегация тромбоцитов, увеличение продукции фактора Виллебранда, липкие тромбоциты и др.
3. Формы, обусловленные дефицитом или аномалиями физиологических антикоагулянтов: дефицит и аномалии антитромбина, протеина С и S и др.
4. Формы, связанные с дефицитом, гиперпродукцией или аномалиями плазменных факторов свертывания крови.
5. Формы, связанные с нарушением фибринолиза.
6. Метаболические формы (атеросклероз, сахарный диабет, гиперлипидемия, гиперлипопротеинемия (а), гипрегомоцистеинемия).
7. Аутоиммунные и инфекционно-иммунные формы (антифосфолипидный синдром, аллергозы и другие иммунные заболевания, иммунные и вирусные тромбоваскулиты, тромбогеморрагические лихорадки, бактериальный эндокардит и другие виды хроносепсиса).
8. Паранеопластические тромбэмболические синдромы (тромботические осложнения при всех видах рака, хирургических и химиотерапевтических вмешательствах).
9. Ятрогенные формы (катетеризация, протезы сосудов, кавальные фильтры, трансплантация стволовых клеток, лекарственные формы – лечение концентратами активированных факторов, гепарином, активаторами плазминогена, прием гормональных контрацептивов и др.).
10. Комбинированные формы.
Таким образом, большинство пациентов стационара и широкий контингент поликлинических больных нуждаются в определении параметров свертывания крови и дальнейшем мониторинге коагуляции. Тромбофилические состояния могут быть выявлены с помощью лабораторных тестов, отражающих склонность к гиперкоагуляции.
Для обследования больных с подозрением на тромбофилию, используют две группы тестов. В первую группу входят маркеры активации свертывания крови. Эти тесты, как правило, доступны обычной клинико-диагностической лаборатории. Они позволяют выявить гиперкоагуляцию, но не дают информации об ее причинах. К данной группе тестов относится ПВ (укорочение), АЧТВ (укорочение), фибриноген (рост), ТВ (изменение), маркеры тромбинемии (увеличение РФМК, ПДФ, Д-димеров).
Тесты на выявление причин тромбофилии проводятся в большинстве случаев после постановки тестов первой группы и купирования тромбоза. Например, определение концентрации гомоцистеина или выявление наследственной аномалии факторов. К сожалению, причина тромбофилии устанавливается далеко не во всех случаях.
В последнее время большое внимание уделяется гипергомоцистеинемии и антифосфолипидному синдрому.
Гипергомоцистеинемияявляется доказанным фактором риска развития как артериального, так и венозного тромбоза. Молекулярные механизмы тромбогенного действия гомоцистеина не идентифицированы.
Гомоцистеин– серосодержащая аминокислота, промежуточный продукт обмена незаменимой аминокислоты метионина.
Гипергомоцистеинемия может быть
• врожденной, связанной с дефицитом одного из ферментов превращения гомоцистеина,
• приобретенной, обусловленной недостатком витаминов В12, В6, и/или фолиевой кислоты, а также применением лекарств, нарушающих функции ферментов или обмен витаминов.
Тяжелая врожденная гипергомоцистеинемия приводит к рецидивирующим артериальным и венозным тромбозам, которые проявляются с детства. Индивидуальный риск развития тромбоза при гипергомоцистеинемии повышается в 3-10 раз.
Референтные пределы содержания гомоцистеина в плазме крови зависят от методики анализа, доступный метод определения – ИФА.
Антифосфолипидный синдром (АФС) - особый синдром, в основе которого лежит развитие аутоиммунной реакции на отрицательно заряженные фосфолипидные детерминанты на мембранах тромбоцитов, эндотелия, нервных клеток и связанные с фосфолипидами этих мембран гликопротеиды. Синдром относится к аутоиммунным тромбогенным гемофилиям как одна из гипокоагуляционных форм. АФС – частая причина приобретенных иммунных тромбофилий. Для синдрома характерно сочетание тромботических и ишемических проявлений с умеренной тромбоцитопенией.У женщин АФС встречается чаще. Патогенез АФС окончательно не установлен.
При АФС наблюдаются повторные тромбозы вен, тромбозы артерий. Акушерская патология проявляется привычным выкидышем (44%), тромбозом сосудов плаценты, внутриутробной гибелью плода, преэклампсией. У пациентов с АФС могут быть поражения нервной системы, головки бедра, кожи, изменения в сердце и сосудах.
При АФС появляются аутоиммунные антитела, которые ингибируют активацию протромбина и вызывают гипокоагуляцию в фосфолипидзависимых коагуляционных тестах без специфического угнетения какого-либо фактора свертывания крови.
У больных с АФС в крови появляются:
1. Антитела к мембранным фосфолипидам – кардиолипину, фосфатидилсерину и др., поэтому синдром иногда называют антикардиолипиновым. Пациенты с АФС могут иметь положительную реакцию Вассермана, так как кардиолипин является реагентом.
2. Антитела к гликопротеидам, связанным с фосфолипидами (аннексину V, β2-гликопротеину-I, протромбину).
3. Волчаночные антикоагулянты (ВА).
Волчаночные антикоагулянты – это группа антифосфолипидных антител всех классов иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG), которые удлиняют время свертывания плазмы в фосфолипидзависимых тестах, таких как протромбиновый тест и АЧТВ. Антикоагулянты названы волчаночными потому, что впервые были обнаружены Conley и Hartman, 1952г, при исследовании крови больных системной красной волчанкой (СКВ). Кроме АФС и СКВ, волчаночные антикоагулянты могут быть обнаружены при других аутоиммунных заболеваниях.
Таким образом, для АФС характерно состояние гиперкоагуляции в организме при гипокоагуляции в фосфолипидзависимых тестах на фоне умеренной тромбоцитопении.
Различают 3 вида антифосфолипидного синдрома (табл. 5).
Таблица 5
Классификация антифосфолипидных синдромов
| Название | Характеристики |
| Первичный АФС | Нет проявлений «фонового» иммунного заболевания. Иногда обнаруживают а/т к ДНК, рост циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Впоследствии может проявиться СКВ или другие коллагенозы |
| Вторичный АФС | Осложнение «фонового» иммунного системного заболевания (СКВ, РА, склеродермия и др.), вирусные инфекции, опухоли, прием лекарств (прокаинамид, хинидин, хлорпромазин) |
| Катастрофический АФС | Быстро прогрессирующий политромботический синдром с циркуляцией в крови ВА и/или антифосфолипидных антител. Лечению не поддается и заканчивается летальным исходом |
Основными клиническими признаками для прицельного обследования пациента на наличие АФС являются тромбозы, ишемии органов, акушерская патология. К дополнительным признакам относится присутствие иммунной патологии, тромбоцитопения, положительная RW.
Для правильной диагностики АФС необходимо проводить лабораторное обследование, включающее:
• Выявление антител к кардиолипину и фосфатидилсерину в высоком титре.
• Выявление антител к гликопротеидам (протромбин и др.).
• Выявление антикоагулянтов волчаночного типа.
Антитела к фосфолипидам и гликопротеидам обнаруживают с помощью иммуноферментного анализа. Эффект волчаночного антикоагулянта выявляют клоттинговыми методами в фосфолипидзависимых тестах. Выявление ВА проходит в 2 этапа: проведение скрининговых тестов, обнаруживающих эффекты, связанные с ВА, и подтверждающих тестов, которые устанавливают, что гипокоагуляция в скриниговых тестах корректируется добавлением тромбоцитарных фосфолипидных мембран или эритрофосфатида.
Обследование пациента на АФС должно быть комплексным. Один иммунологический тест не обеспечивает надежного распознавания АФС. Ошибка составляет от 35 до 60%.
Для лечения АФС используют антикоагулянты прямого и непрямого действия, антиагреганты, иммуносупрессоры цитостатического действия, дискретный плазмаферез.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Основные понятия.
Лабораторные тесты неотделимы от диагностики и мониторинга нарушений гемостаза, особенно при мониторинге антикоагулянтной терапии. Для оценки системы гемостаза используются следующие группы тестов:
1. Свертывание плазмы (коагуляционное звено).
· Скрининговые тесты.
· Исследование факторов (активность и концентрация).
· Маркеры активации свертывания.
· Ингибиторы свертывания.
2. Фибринолиз.
· Скрининговые тесты.
· Факторы фибринолиза (плазминоген, t-PA).
· Маркеры фибринолиза.
· Ингибиторы фибринолиза.
3. Исследование тромбоцитов (количество, функции, факторы тромбоцитов).
В лечебных учреждениях общего профиля проводятся, как правило, скрининговые тесты, которые оценивают функцию отдельных фаз процессов свертывания, то есть совместную активность нескольких факторов. Другие тесты обычно выполняются в профильных лабораториях или специализированных лечебных учреждениях, хотя, в принципе, могут проводиться в любой КДЛ, имеющей соответствующее оборудование.
При назначении анализов на гемостаз врач руководствуется наличием клинических признаков, анамнезом, вероятностью оперативного вмешательства, а также возможностями лаборатории. В зависимости от диагностической необходимости пациентам назначается исследование коагулограммы или гемостазиограммы.
Коагулограмма предполагает изучение плазменного звена гемостаза. Гемостазиограмма включает одновременную оценку плазменного и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. При рутинных исследованиях минимальный набор тестов для сосудисто-тромбоцитарного звена состоит из определения времени кровотечения и количества тромбоцитов. Более тонкое изучение функции тромбоцитов проводится с помощью специальных методов и приборов.
Пациентам без видимой клинической симптоматики и перед оперативным вмешательством назначается базовая коагулограмма. Минимальное количество параметров базовой коагулограммы четыре: протромбиновое время (ПВ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), тромбиновое время (ТВ) и фибриноген. Эти тесты относятся к скрининговым и позволяют выявить нарушения на всех этапах коагуляции. Данный набор тестов может выполняться как ручными методами, так и на коагулометре. Однако минимального набора тестов недостаточно для пациентов с нарушениями в системе гемостаза. Учитывая трудоемкость и немалую стоимость тестов, в КДЛ должны быть «резервные» тесты, которые выполняются только по назначению лечащего врача дополнительно к базовой коагулограмме. Эти тесты, как правило, скрининговые, и позволяют оценить функциональную активность других звеньев гемостаза. К ним относятся: фибринолитическая активность (ФАК, скрининговый тест на фибринолиз), оценка активности физиологических антикоагулянтов (антитромбина и общей активности системы протеина С), оценка уровня тромбинемии (РФМК, Д-Димеры и др.), выявление эффектов волчаночного антикоагулянта и некоторые другие. Все эти тесты доступны для выполнения, и для них, кроме Д-димеров, имеются отечественные реагенты. Д-димеры определяется иммунологическими методами и требует специального оборудования. Набор тестов должен соответствовать потребностям лечебного учреждения. Редкие тесты рациональнее проводить в специализированной лаборатории из-за их нерентабельности.
Для общей оценки системы гемостаза проводится тромбоэластография (ТЭГ) или тромбоэластометрия (ТЭМ). Методы дорогие, но в ряде случаев крайне необходимые.
Таким образом, каждая КДЛ выделяет диапазон исследований, который определяется потребностями лечебного учреждения и возможностями лаборатории.
Тромбиновое время
Тромбиновое время (ТВ) характеризует конечный этап процесса свертывания плазмы: превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина. Тест является скрининговым на полимеризацию фибриногена/фибрина и на антикоагулянтную активность плазмы.
Принцип метода заключается в определении времени свертывания БТП при добавлении к ней стандартной концентрации тромбина. Так как тромбин непосредственно активирует фибриноген, тест не нуждается в добавлении кальция или каких-либо дополнительных реагентов. При проведении теста используется тромбин низкой или средней концентрации. Тромбин низкой концентрации вызывает образование сгустка в течение 15-20 сек. (референтные значения указаны в методике анализа). Он используется для скриниговых исследований. При работе с плазмой, содержащей гепарин, рекомендуется более высокая концентрация тромбина, так как комплекс антитромбин-гепарин, который образуется при введении гепарина, быстро нейтрализует добавленный тромбин. Тест очень чувствителен к гепарину. Сразу после внутривенного введения гепарина и в терминальной фазе ДВС-синдрома в тромбиновом тесте кровь не сворачивается. ТВ удлиняется при заборе крови через катетер, обработанный гепарином.
Для правильной интерпретации результатов теста к пробе крови, содержащей гепарин, допускается добавить протаминсульфат для нейтрализации гепарина или измерить рептилазное время. Рептилаза или батроксобин – это коагулаза из яда змеи щитомордника. Она действует аналогично тромбину, но не подвержена влиянию гепарина.
Удлинение ТВ (гипокоагуляция):
1. Снижение концентрации фибриногена до 1-0,5 г/л.
2. Качественное изменение молекулы фибриногена (дисфибриногенемия).
3. Введение антикоагулянтов прямого действия (гепарина).
4. Высокое содержание ПДФ при повышенном фибринолизе, лечении фибринолитиками, ДВС-синдроме.
5. Наличие патологических ингибиторов.
Ингибиторы, удлиняющие ТВ, делятся на ингибиторы полимеризации, которых большинство, и ингибиторы тромбина. Ингибиторы полимеризации – это аномальные иммуноглобулины, которые нарушают процесс полимеризации фибриногена. Все ингибиторы ассоциированы с основным заболеванием, например, множественной миеломой, и представлены парапротеинами или криоглобулинами. При наличии ингибиторов тромбина время свертывания в рептилазном тесте остается нормальным.
В ряде случаев удлинение ТВ наблюдается при уремии и при наличии ВА.
Определение ТВ полезно при проведении фибринолитической и гепаринотерапии.
Укорочение ТВ свидетельствует о гиперкоагуляции и риске тромбозов.
Фибриноген.
Фибриноген – это белок плазмы крови, который синтезируется в печени. Содержание фибриногена практически не зависит от пола и возраста. Хотя сам по себе он не активирует гемостаз, эпидемиологические исследования показали, что фибриноген является независимым фактором риска инфаркта миокарда и ишемического инсульта. Рост содержания фибриногена увеличивает тенденцию к тромбообразованию, усиливает агрегацию тромбоцитов, ухудшает реологические свойства крови, способствует атеросклерозу и повышает риск развития тромбозов. Однако пределы для терапевтического вмешательства пока не определены.
Фибриноген является белком острой фазы воспаления. При тяжелых бактериальных инфекциях, травме, тромбозе он может повышаться до 10г/л и более. Рост содержания фибриногена коррелирует с повышением СОЭ.
Референтные пределы 2-4 г/л.
Основные методы определения.
1. Клоттинговый метод по Клаусу является наиболее адекватным и распространенным методом и относится к функциональным тестам. Он основан на определении времени образования сгустка при добавлении к разведенной в 10-20 раз плазме тромбина в высокой концентрации. Между временем образования сгустка и концентрацией фибриногена выявлена логарифмическая зависимость. Метод требует предварительного построения калибровочного графика в соответствии с инструкцией к набору реактивов. При отсутствии программируемых коагулометров данным методом пользоваться нежелательно: небольшая погрешность в определении времени коагуляции приводит к значительным ошибкам в содержании фибриногена. К ограничениям метода относится чувствительность результатов к гипер-, дис-, гиперфибриногенемии и избытку ПДФ, которые снижают активность полимеризации фибриногена.
2. Определение фибриногена по Р.А. Рутберг. Метод основан на взвешивании высушенного фибринового сгустка после добавления к 1 мл плазмы тромбопластин-кальциевой смеси или тромбина. Метод ручной, мало чувствительный и воспроизводимый и считается устаревшим. Однако при гипо- и дисфибриногенемиях его результаты более надежные, чем при методе Клауса.
3. Другие методы (турбидиметрические, фотометрические с использованием хромогенных субстратов, иммунохимические) относятся к концентрационным, так как непосредственно определяют концентрацию фибриногена.
Увеличение содержания(гиперкоагуляция): воспаление, некроз, курение, заболевания почек, коллагенозы, новообразования, атеросклероз, прием оральных контрацептивов, беременность, сахарный диабет, ожирение, стресс.
Снижение содержания(гипокоагуляция): врожденный дефицит, ДВС, печеночно-клеточная недостаточность, острый фибринолиз, лейкозы, инфекционный мононуклеоз, действие лекарственных препаратов (рептилаза, фибраты, фенобарбитал, стрептокиназа, урокиназа, актилизе и др.), физическая нагрузка.
Дисфибриногенемия характеризуется наличием функционально дефектной молекулы фибриногена в плазме крови. Наследственные дисфибриногенемии встречаются редко. Они протекают чаще бессимптомно, иногда с тенденцией к кровоточивости или тромбозам. Приобретенная дисфибриногенемия наблюдается у пациентов с тяжелыми заболеваниями печени. Дисфибриногенемии характеризуются следующими лабораторными показателями:
· увеличением тромбинового и рептилазного времени,
· расхождением результатов при измерении уровня фибриногена функциональным тестом (по Клаусу, низкое) и концентрационным (более высокое или нормальное).
Дополнительные тесты.
Оценка системы фибринолиза. Фибринолитическая активность.
Для оценки системы фибринолиза можно проводить тесты, которые позволяют измерить концентрацию тех или иных факторов (плазминоген, α2-антиплазмин, концентрацию плазмин-антиплазминового комплекса и др.). Однако наиболее общее представление о системе фибринолиза может быть получено при проведении традиционного функционального теста – оценки фибринолитической активности крови (ФАК). Тест отличает простота исполнения и отсутствие специального оборудования. Недостатком является невозможность автоматизации. Результат теста на ФАК зависит от уровня фибриногена, качества полимеризации фибрина и наличия гепарина.
В настоящее время используется две модификации теста.
1. Спонтанный эуглобулиновый фибринолиз. При осаждении белков плазмы крови слабой, как правило, уксусной кислотой, происходит осаждение так называемой эуглобулиновой фракции, которая содержит фибриноген, факторы свертывания, плазминоген и его активаторы, но практически свободна от ингибиторов фибринолиза. При таком мягком осаждении белки не теряют своих свойств. После растворения осажденных белков в буферном растворе, добавлении CaCl2 и образовании после этого фибринового сгустка время лизиса сгустка отражает ФАК. Референтные пределы 2-4 часа.
2. XIIа-зависимый фибринолиз (или Хагеман-зависимый фибринолиз, ф. XII - фактор Хагемана) отличается от спонтанного тем, что при осаждении белков в реакционную смесь добавляют каолин. Каолин является активатором ф. XII и внутреннего пути фибринолиза. Время проведения анализа резко сокращается, так как лизис сгустка составляет 4-12 мин.
При выборе метода оценки ФАК необходимо учитывать особенности патологии пациента. Так, при скрининговых исследованиях, при обследованиях беременных и других пациентов с тромбофилией, адекватным будет определение XIIа-зависимого фибринолиза. Для пациентов с ДВС-синдромом, после операций на органах внутренней секреции или с метастазирующими опухолями, а также при других состояниях с возможностью гиперфибринолиза, более подходит определение спонтанного эуглобулинового фибринолиза: при активации фибринолиза время лизиса сгустка сокращается, а достоверно визуально отследить растворение сгустка за период времени менее 4-х минут практически невозможно.
Активация фибринолиза (укорочение времени лизиса сгустка, гипокоагуляция) наблюдается при уменьшении концентрации фибриногена, гипо- и дисфибриногенемиях, панкреатитах и панкреонекрозах, операциях на органах внутренней секреции и легких, акушерских осложнениях, введении адреналина, пирогенных реакциях, метастазирующих опухолях, ДВС-синдроме, снижении уровня ингибиторов плазминогена, лечении фибринолитиками и активаторами плазминогена.
Ингибирование фибринолиза (удлинение времени лизиса сгустка, гиперкоагуляция) наблюдается при гиперфибриногенемии, врожденном дефиците плазминогена или его аномалиях, снижении плазминогена и его активаторов при повышенном потреблении или сниженном синтезе (тромбозы, васкулиты, сепсис, заболевания печени, ДВС-синдром), беременности.
Тест может применяться для контроля эффективности лечения фибринолитиками.
Антитромбин.
Антитромбин – это гликопротеид с ОММ 58000Д, который синтезируется в печени. В связи с низкой ОММ (<70000Д) он легко выводится через почки. АТ ингибирует сериновые протеазы, в первую очередь тромбин (ф. IIа) и ф. Ха. В присутствии гепарина активность АТ увеличивается в тысячи раз. Противосвертывающее действие гепарина реализуется через АТ, без которого гепарин не оказывает антикоагулянтного эффекта. По литературным данным, на долю АТ приходится 75-90% всего антикоагулянтного потенциала.
Методы определения.
1. Клоттинговые методы. Это скриниговые функциональные методы, которые оценивают активность АТ по ингибирующему действию на тромбин. Тест калибруется по нормальной донорской плазме и оценивается в процентах. Референтные значения составляют от 75 до 125%.
2. Методы с хромогенн