Определение количества CD4 лимфоцитов
Определение количества CD4 лимфоцитов проводится методом проточной цитофлюориметрии. Принцип метода:
§ в проточном цитометре клетки крови разделяются по их размеру (объему);
§ добавленные меченные красителем моноклоновые антитела, соединяясь с комплементарными им CD4 рецепторами лимфоцитов/ моноцитов, вызывают изменение окраски рабочего раствора, что определяется флюориметрически.
Метод является дорогостоящим, стоимость одного исследования в Европе составляет около 50-100 ?.
Результаты определения количества CD4 лимфоцитов позволяют судить о степени Т-клеточного иммунодефицита, что необходимо для:
§ установления иммунологической категории (стадии) ВИЧ-инфекции (табл. 6), количество CD4 лимфоцитов – это самый надежный показатель констатации прогрессирования заболевания;
§ установления показаний для начала и отмены профилактического лечения оппортунистических инфекций;
§ установления показаний для начала АРТ;
§ слежения за иммунологическим ответом на АРТ (восстановление количества CD4 лимфоцитов на фоне эффективного лечения).
Таблица 6 – Классификация иммуносупрессии по ВОЗ, 2006 г.
| иммунологическая категория | CD4, % от лимфоцитов | CD4, копий/мл | |||
| ≤ 12 месяцев | > 13 месяцев | ≤ 1 года | 1-5 лет | ≥ 6 лет и взрослые | |
| отсутствие значимой иммуносупрессии | ≥ 30 | ≥ 25 | ³ 1500 | ³ 1000 | ≥ 500 |
| легкая иммуносупрессия | 25-29 | 20-24 | 1000-1500 | 750-1000 | 350-500 |
| умеренная («продвинутая») иммуносупрессия | 20-24 | 15-19 | 750-1000 | 500-750 | 200-350 |
| выраженная иммуносупрессия | < 20 | < 15 | < 750 | < 500 | < 200 |
У подростков и взрослых количество CD4 лимфоцитов традиционно выражают в клетках/мкл. У детей до наступления второго лейкоцитарного перекреста абсолютное количество CD4 лимфоцитов меняется в зависимости от возраста, снижаясь до «нормальных взрослых» значений только примерно к 6 годам. Так у детей первых 5 лет количество CD4 лимфоцитов выражают не в абсолютных значениях, а в процентах от лимфоцитов, поскольку этот показатель относительно стабилен.
При проточной цитофлюориметрии определяется процентное содержание CD4 лимфоцитов, а затем, располагая данными о количестве лимфоцитов и лейкоцитов в крови, производят пересчет в абсолютные значения. Пример пересчета. Результаты обследования ребенка 2-х лет: лейкоциты – 8 х 109/л, лимфоциты – 50%, CD4 клетки – 25%. Абсолютное количество CD4 лимфоцитов = 8 х 109/л х 50% х 25% = 1 х 109/л, или 1000 х 106/л (1000 клеток/мкл). То есть ребенок имеет нижнюю границу нормальных значений CD4 лимфоцитов, как по процентному содержанию (25%), так и по абсолютным значениям (1000 клеток/мкл). Данный пересчет обычно производят уже сотрудники лаборатории, и клиницист получает результат анализа, выраженный как в процентах, так и в абсолютных значениях.
Процентное содержание CD4 лимфоцитов более точно отражает уровень иммуносупрессии, поскольку не происходит суммирования погрешностей, возникающих при измерении трех различных показателей, требующихся для подсчета абсолютного количества CD4 лимфоцитов. По данным лабораторий, проводящих исследования ACTG, результаты определения процентного содержания лимфоцитов CD4 в одном и том же образце крови различались на 18%, а результаты определения абсолютного количества лимфоцитов CD4 – на 25%.
Количество CD4 лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов, не получающих АРТ, с течением времени снижается. Это снижение происходит в среднем на 4% в год на каждый lg РНК ВИЧ. То есть очень усредненно можно предполагать, что при вирусной нагрузке менее 1,5 тысяч копий/мл количество CD4 лимфоцитов будет снижаться не более чем на 12% в год, а при вирусной нагрузке 100 тысяч копий/мл следует ожидать снижения количества CD4 лимфоцитов на 20% в год.
Клиническая трактовка результатов определения количества CD4 лимфоцитов сложна, так как:
§ диапазон нормальных значений CD4 лимфоцитов весьма широкий (табл. 7), в большинстве лабораторий за норму принято количество CD4 лимфоцитов 800-1050 клеток/мкл; диапазон в два стандартных отклонения составляет приблизительно 500–1400 клеток/мкл;
§ на уровень CD4 влияет масса посторонних факторов: время суток при заборе (минимальный уровень наблюдается в 12:30, а максимальный – в 20:30), наличие острых заболеваний, операций или вакцинации, прием вызывающих лейкопению лекарств (например, прием интерферона-α для лечения ко-инфекций вирусами гепатитов, прием глюкокортикостероидов) и пр.;
§ практически не влияют на количество CD4 лимфоцитов пол, возраст (у взрослых), принадлежность к группам риска, психическое и физическое перенапряжение, беременность;
§ количество CD4 лимфоцитов в сыворотке не равно количеству CD4 лимфоцитов в организме (исследуемый нами сывороточный пул составляет около 20% всех CD4 лимфоцитов, находящихся в организме), и резкие изменения могут быть обусловлены перераспределением лейкоцитов между периферической кровью и костным мозгом, селезенкой и лимфоузлами;
§ ложнозавышенное количество CD4 лимфоцитов может определяться у пациентов после спленэктомии и при ко-инфекции ВИЧ и HTLV-1;
§ при определении CD4 лимфоцитов нет учета их функциональной активности (например, при ВИЧ-инфекции преимущественно поражаются наивные Т-лимфоциты при относительной сохранности клеток памяти);
§ лимфоцитарные перекресты у детей затрудняют трактовку абсолютных значений количества CD4 лимфоцитов.
Таблица 7 – Субпопуляции лимфоцитов: диапазоны нормальных значений
| лимфоциты | ед. измер. | возраст | ||||
| 5 дней –3 мес | 4-8 мес | 1-2 года | 2-5 лет | >5 лет и взрослые | ||
| общие | % | 55-78 | 45-79 | 44-72 | 38-64 | - |
| х 109/л | 2,9-8,8 | 3,6-8,8 | 2,1-8,3 | 2,4-5,9 | 1,1-5,9 | |
| CD3 | % | 60-87 | 57-84 | 53-81 | 62-80 | 66-76 |
| х 109/л | 2,0-6,5 | 2,2-6,5 | 1,4-5,4 | 1,6-4,2 | 0,7-4,2 | |
| CD4 | % | 41-64 | 36-61 | 31-54 | 35-51 | 33-41 |
| х 109/л | 1,4-5,1 | 1,6-4,6 | 1,02-3,6 | 0,9-2,9 | 0,3-2,0 | |
| CD8 | % | 16-35 | 16-34 | 16-38 | 22-38 | 27-35 |
| х 109/л | 0,6-2,4 | 0,7-2,5 | 0,5-2,2 | 0,6-1,9 | 0,3-1,8 | |
| B | % | 12-22 | ||||
| х 109/л | 0,2-1,6 | |||||
| CD16 | % | 9-16 | ||||
| х 109/л | 0,09-0,9 |
В связи с вышеизложенным, при трактовке результатов определения количества CD4 лимфоцитов следует учитывать следующее:
§ забор крови следует проводить в одно и то же время суток, не ранее чем через 1 неделю после исчезновения симптомов острой инфекции (если невозможно – то все заборы проводить в примерно схожем клиническом состоянии пациента) и не ранее чем через 1 неделю после вакцинации;
§ исследование крови следует проводить всегда одним и тем же методом в одной и той же лаборатории;
§ и лечащие врачи, и пациенты должны быть осведомлены о вариабельности результатов определения количестваCD4 лимфоцитов (например, если у пациента количество CD4 лимфоцитов составляет 200 клеток/мкл, то 95%CI составляет 118–337 клеток/мкл);
§ при принятии клинических решений (например, о начале медикаментозной профилактики оппортунистической инфекции или АРТ) следует оценивать комплексно клиническую картину и результаты определения количества CD4 лимфоцитов;
§ при принятии клинических решений, основанных на результатах определения количества CD4 лимфоцитов, нельзя делать заключений на основании единственного результата, а следует проводить повторное определение количества CD4 лимфоцитов (через 1-3-6 месяцев в зависимости от состояния пациента) с клинической интерпретацией при получении сходных или объяснимо изменяющихся результатов;
§ у детей первых 5 лет следует ориентироваться на процентное содержание CD4 лимфоцитов, а не на абсолютные значения.
На основании обнаружения сниженного количества CD4 лимфоцитов нельзя диагностировать ВИЧ-инфекцию, так как снижение CD4 лимфоцитов возможно при других болезнях (туберкулез, синдром Шегрена, саркоидоз, лучевая болезнь, атопический дерматит, системные заболевания соединительной ткани и васкулиты, прием кортикостероидов, лимфомы и пр.) или даже у относительно здоровых людей (идиопатическая CD4 лимфоцитопения).
В условиях ограниченных ресурсов иногда вместо количества CD4 лимфоцитов определяют общее количество лимфоцитов. DHHS рекомендует рассматривать снижение общего количества лимфоцитов до <1200 клеток/мкл в сочетании с клиническими симптомами ВИЧ-инфекции как показание к началу АРТ, аналогичное снижению CD4 лимфоцитов до <200 клеток/мкл. Если общее количество лимфоцитов находится в пределах 1200–2000 клеток/мкл, то снижение количества CD4 лимфоцитов до <200 клеток/мкл можно заподозрить у пациентов с низким уровнем гемоглобина (≤120 г/л).