Ферментативный спектр – таксономический признак

Транспорт веществ в бактериальную клетку. Существует два типа переноса веществ в бактериальную клетку: пассивный и активный. При пассивном переносе вещество проникает в клетку только по градиенту концентрации. Затраты энергии при этом не происходит. Различают две разновидности пассивного переноса: простую диффузию и облегченную диффузию.

Простая диффузия – неспецифическое проникновение веществ в клетку, при этом решающее значение имеет величина молекул и липофильность. Скорость переноса не значительна.Облегченная диффузия протекает с участиембелка-переносчика.Скорость этого способа переноса зависит от концентрации вещества в наружном слое.

Активный транспорт веществ в клетку. При активном переносе вещество проникает в клетку против градиента концентрации при помощи белка-переносчика – пермеазы. При этом происходит затрата энергии. Имеется два механизма активного транспорта.

Механизмы активного транспорта веществ в клетку. Активный транспорт: небольшие молекулы (аминокислоты, сахара) «накачиваются» в клетку, создается концентрация в 100-1000 раз выше, чем снаружи клетки

Второй механизм– транслокация радикалов,

обеспечивает транспорт сахаров (глюкоза, фруктоза). В процессе переноса происходит химическая модифиция – фосфорилирование. Для осуществления активного транспорта в бактерии имеется специальная фосфотрансферная система.

Фосфотрансферная система. Составной частью этой системы является активный фосфорилированныйбелок-переносчик(АФБ). АФБ связывает свободный сахар на наружной поверхности ЦПМ, транспортирует его в цитоплазму, где сахар освобождается в виде фосфата. Далее фосфаты вступают в цепь биохимических реакций, в результате образуются АТФ и ингредиенты для биосинтеза компонентов клетки. Это называется конструктивным метаболизмом.

Энергетический метаболизм. Типы метаболизма: окислитель-

ный, или дыхание; бродильный, или ферментативный; смешанный. Пути расщепления глюкозы при использовании ее в качестве ис-

точника углерода и энергии:

через образованиефруктозо-1,6-дифосфата(ФДФ-путь).Выход: 2 молекулы пирувата, 2 молекулы АТФ, 2 молекулы восстановленного НАД;

через пентозофосфатный путь(ПФ-путь).Выход: 1 молекула3-фосфоглицеринальдегида,3 молекулы СО2, 2 молекулы восстановленного НАД.

через путьЭтнера-Дудорова.Выход: 1 молекула АТФ, 1 молекула восстановленного НАД, 1 молекула восстановленного НАДФ.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

2.Оптимальные температура, рН, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы – растут при температурах ниже +20 0С.

2.Мезофиллы – растут в диапозоне температур от 20 до 45 0С (часто оптимум – при +370С).

3.Термофилы – растут при температурах выше + 45 0С.

Краткая характеристика питательных сред. По консистенции

выделяют жидкие, плотные (1,5-3%-ныйагар) и полужидкие (0,3- 0,7 % агар) среды.

Агар – полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяютпептоны – продукты ферментации белков пепсином, различныегидролизаты (мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.).

По назначению среды разделяют на ряд групп:

универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов(мясо-пептонныйбульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА);

специальные – среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (средаМак-Коядля выделения возбудителя туляремии, средаЛевенштейна-Йенсена– возбудителя туберкулеза);

дифференциально-диагностические– для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

селективные (элективные) – для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих – пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая культура – популяция одного вида микроорганизмов. Основные принципы получения чистых культур: механическое

разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и др).

Лекция 7

ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ

Открытие вирусов Д.И. Ивановским в 1892 г. положило начало развитию науки вирусологии. Быстрому ее развитию способствовали изобретение электронного микроскопа, разработка метода культивирования микроорганизмов в культурах клеток.

Слово «вирус» в переводе с латинского – яд (животного происхождения). Этот термин применяют для обозначения уникальных представителей живой природы, не имеющих клеточного (эукариотического или прокариотического) строения и обладающих облигатным внутриклеточным паразитизмом, т.е. не могут жить без клетки.

В настоящее время вирусология – бурно развивающаяся наука, что связано с:

ведущей ролью вирусов в инфекционной патологии человека (примеры: вирус гриппа, ВИЧ – вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус и другие герпесвирусы) на фоне практически полного отсутствия средств специфической химиотерапии;

использованием вирусов для решения многих фундаментальных вопросов биологии и генетики.

Вирусы – доклеточная форма существования живой материи, облигатные внутриклеточные паразиты, способные только к внутриклеточному размножению. Вирусы относятся к царствуVira.

Таксономические категории. Семейство имеет окончание viridae,

подсемейство – virinae, род –virus. Названия родов подсемейств даны не для всех вирусов. Вид вируса не получил биноминального названия, как у бактерий.

В основу классификации вирусов положены категории:

Тип НК (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей (1 или 2).

Особенности репликации вирусного генома. Размер и морфология вирионов.

Количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида. Наличие оболочки (суперкапсида).

Место размножения в клетке. Антигенные свойства и др.

Основные свойства вирусов. Ультрамикроскопические размеры, нм (от 15-20 до 350-400 нм). Один тип нуклеиновой кислоты – ДНК или РНК. Отсутствие способности к росту и бинарному делению. Размножение за счет воспроизводства себя из собственного генома. Отсутствие собственных систем мобилизации энергии. Отсутствие способности к синтезу белка. Среда обитания:бактерии, клетки растений, животных и человека.

Структура вириона. Различают: просто устроенные вирусы

(вирусы полиомиелита, гепатита А), которые состоят из нуклеиновой кислоты и капсида; сложно устроенные вирусы (вирусы кори, гриппа, герпеса, коронавирусы), состоящие из нуклеиновой кислоты, капсида и липопротеиновой оболочки (суперкапсид). В центре вириона – нуклеиновая кислота, окруженная капсидом. Капсид состоит из белковых субъединиц – капсомеров. Количество капсидов и способ их укладки строго постоянны для каждого вида вируса (вирус полиомиелита – 32 капсомера, аденовирус – 252). Суперкапсид у сложных вирусов образуется при выходе его из клетки хозяина. Вирусный капсид обволакивается внутренней поверхностью цитоплазматической мембраны клетки хозяина, и образуется один или несколько слоев оболочки –суперкапсид (вирусы бешенства, герпеса, энцефалита). У некоторых вирусов от внешнего липидного слоя оболочки выступают капсомеры в виде шипов –пепломеры (вирус гриппа). Нуклеиновая кислота вируса является носителем наследст-

венных свойств. Капсид и суперкапсид несут защитные функции, а также способствуют проникновению вируса в клетку.

Морфология вириона. В зависимости от способа укладки капсида различают формы: кубическую (икосаэдрическая); сферическую; палочковидную; пулевидную; спермазоидную.

Химический состав вирусов. Количество и содержание ДНК и РНК вирусов не одинаковы.Белки содержатся в незначительном количестве, состоят из16-20-иаминокислот. Функции: антигенные свойства, защита от ферментов клетки хозяина.Липиды и углеводы содержатся во внешней оболочке вирионов. Их источником является оболочка клетки хозяина.Ферменты вирусов. У большинства вирусов нет ферментов, т.к. они не имеют собственного метаболизма. Некоторые вирусы имеют ферменты, способствующие их проникновению в клетку хозяина (вирус гриппа А – нейраминидаза, фаги – лизоцим).

Пути передачи вирусов: воздушно-капельный(грипп, оспа), алиментарный (полиомиелит, гепатит А),контактно-бытовой(бешенство), трансмиссивный (энцефалит).

Пути проникновения вируса в клетку хозяина: рецептор-

зависимый эндоцитоз (виропексис), слияние оболочки вируса с клеточной мембраной.

Рецептор-зависимый эндоцитоз (виропексис): сначала идет ад-

сорбция вириона и клетки и далее захватывание и поглощение вириона клеткой. Клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячивается, образуется внутриклеточная вакуоль с вирусом. Содержимое вакуоли закисляется, вирусный нуклеокапсид выходит в цитоплазму клетки-хозяина.

Слияние оболочки вируса с клеточной мембраной характерно только для сложных вирусов (белки слияния). Происходит точечное взаимодействие вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны, вирусная липопротеиновая оболочка интегрируется с клеточной мембраной, а внутренний компонент попадает в цитоплазму клетки-хозяина.

Репликация вируса в клетке хозяина:

«Раздевание вируса» (депротеинизация). Удаляются поверхностные структуры: оболочка и капсид, высвобождается вирусная НК и транспортируется к местам депротеинизации.

Синтез вирусных компонентов.Происходит репликация НК и синтез вирусных белков при участии ДНК или РНК клетки хозяина.

Формирование вирусов – самосборка белковых частиц вокруг вирусной НК.

У одних вирусов самосборка происходит в цитоплазме, у других – в ядре клетки хозяина.

Образование внешней оболочки всегда происходит в цитоплазме.

Выход вирусов из клетки хозяина:

Взрывной путь: из погибающей клетки одновременно выходит большое количество вирионов. По взрывному пути выходят из клетки вирусы, не имеющие липопротеиновой оболочки.

Почкование, экзоцитоз характерно для сложных вирусов. Образовавшийся нуклеокапсид вириона транспортируется к мембранам клетки, в области контакта нуклеокапсида вириона с клеточной мембраной начинается выпячивание этих участков. Клетка способна длительно сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство.

Типы взаимодействия вируса и клетки хозяина:

Продуктивный тип завершается образованием нового поколения вирионов и гибелью зараженных клеток.Гибель (лизис) клеток (цитопатический эффект) – результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц. Это характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер;стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные ин-

фекции) – так называемая вирусная трансформация клетки.

Абортивный тип – новые вирионы не образуются, т.к. инфекционный процесс прерывается на одном из этапов. Когда клетки освобождаются от вируса при инфицированиидефектным вирусом, для репликации которого нуженвирус-помощник,самостоятельная репликация этих вирусов не возможна. Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатита B, егоHbs-антигена,аденоассоциированный вирус – в присутствии аденовируса); при инфицировании вирусом генетически не чувствительных к нему клеток; при заражении чувствительных клеток вирусом в определенных условиях.

Интегративный тип, или вирогения –встраивается вирусная ДНК в хромосому клетки и совместно сосуществует. Обеспечивается синхронность репликации вирусной и клеточной ДНК. Встраиваться в ДНК-геном хозяина могут только ДНК-вирусы (принцип «ДНК в ДНК»). Единственные РНК-вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина, – ретровирусы – имеют для этого специальный механизм. Особенность их репродукции: синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина.

Генетика вирусов. Геном вирусов содержит от 6 до нескольких сотен генов. Представлен различными видами нуклеиновых кислот:2-нитевыми,1-нитевыми,линейными, кольцевыми, фрагментированными. СредиРНК-содержашихвирусов различают:

Вирусы сплюс-нитьюРНК: (+)нить несет наследственную информацию и функцию иРНК.

Вирусы с(-)нитьюРНК:(-)нитьвыполняет только наследственную функцию.

Мутации вирусов:

Мутации могут возникнуть во время репликации нуклеиновой кислоты. Природа мутагенов: физические и химические факторы.

Генетическая рекомбинация– одновременное заражение клетки хозяина двумя вирусами, при этом возможен обмен отдельными генами между вирусами. Образуются рекомбинанты, содержащие гены двух родителей.

Генетическая реактивация генов происходит при скрещивании инактивированного вируса с полноценным, что приводит к спасению инактивированного вируса.

Методы культивирования вирусов:

вирусы размножаются только в жизнеспособных клетках; вирусы культивируют в куриных эмбрионах;

вкультурах ткани человека и животных;

ворганизме чувствительных животных.

Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона: на хорион-аллантоисную оболочку; в аллантоисную полость; амниотическую полость; желточный мешок. Температурный режим и длительность инкубации зависит от биологических свойств введенного вируса.

Культивирование вирусов в культуре клеток

Используют ткани человека и различных животных. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоских сосудах-матрицах. Присутствие вирусов в культурах тканей обнаруживают по изменению клеток. Тип вируса определяют реакцией нейтрализации типоспецифическими сыворотками.

Типы клеточных культур:

1.Первичные (трипсинизированные) культуры – фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т.д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации. Используют их однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2.Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило, не более20-ипассажей (т.к. теряют исходные свойства).

3.Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе, например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.

Специальные питательные среды для культур клеток

Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста – среда 199, игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L- цистеин иL-глютамин.

В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови), их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, иподдерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием) для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Проявления вирусной инфекции клеточных культур:

1.Цитопатический эффект.

2.Выявление телец включений.

3.Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА), электронной микроскопией, авторадиографией.

4.Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2) – красный. Размножение клеток меняет рН и, соответственно, цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.

5.Выявление гемагглютинина вирусов – гемадсорбция, гемагглютинация.

6.Метод бляшек (бляшкообразование). В результате цитолитического действия многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки – вирусные «клеточно-негативные»колонии.

Методы идентификации вирусов: РГА (реакция гемагглютина-

ции); РТГА (реакция торможения гемагглютинации); РНГА (реакция непрямой гемагглютинации); РПГА (реакция прямой гемагглютинации); РСК (реакция связывания комплемента).

Бактериофаги

Бактериофаги – вирусы бактерий. Фаги могут инфицировать и разрушать только молодые развивающиеся клетки, являясь их паразитами.

Морфология фагов: фаги состоят из головки и хвостового отростка. Размеры фагов, форма и величина головки, длина и строение отростка различны у разных фагов.

Химический состав фагов. Как и все вирусы, фаги состоят из НК одного типа и белка. Молекула НК, скрученная в спираль, находится в головке фага. Капсид фага и отросток имеют белковую природу. На свободном конце отростка содержится литический фермент (лизоцим).

Специфичность фагов. Фаги обладают строгой специфичностью. Различают виды специфичности: видовая – способны паразитировать только в определенном виде бактерий (стрептококковый, стафилококковый, холерный и т.д.); типовая – способны паразитировать только на определенных представителях данного вида; поливалентная – способность лизировать бактерии близких видов (виды из рода возбудителей дизентерии (шигелл).

Взаимодействие фага с клеткой. Весь цикл взаимодействия фага с клеткой проходит в разных системах «фаг-бактерия» от нескольких минут до 1-2 ч в несколько стадий:

адсорбция – с помощью нитей хвостового отростка фаг адсорбируется на поверхностных рецепторах клетки. Адсорбция фагов специфична;

проникновение – стержень фага «прокалывает» клеточную стенку. Фермент, находящийся в отростке (лизоцим), разрушает ЦПМ. Чехол отростка сокращается, через канал стержня НК фага «впрыскивается» в клетку. Пустая белковая оболочка остается снаружи;

репродукция – репродукция белка и НК фага происходит внутри клетки;

сборка и формированиезрелых частиц фага;

лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Разрывается клеточная стенка, и в окружающую среду выходит несколько сотен новых фагов, способных поражать свежие клетки.

Практическое применение фагов: фагопрофилактика и фаготе-

рапия – предупреждение и лечение инфекций с помощью фагов. Фагодиагностика: идентификация выделенных культур; определение неизвестного фага по тест-культуремикробов; ускоренный метод диагностики инфекций с помощью реакции нарастания титра фага.

Лекция 8