Методика проведения выявления антител: исследование сыворотки на наличие антител с применением желатина.

Оборудование и реактивы:

· 10% раствор желатина

· тест-эритроциты для скрининга антител

· раствор натрия хлорида 0,9%

· термостат лабораторный на +48°С или водяная баня на +48°С

· пробирки вместимостью 5-10 мл

· пипетки

· штативы

· часы (секундомер)

Порядок проведения исследования:

1. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.

2. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.

3. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойств застудневать при температуре +4-8°С, желатин не пригоден.

4. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре +46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 минут.

5. В пробирки, по извлечении их из водяной бани или термостата, наливают 5-8 мл раствора NaCl 0,9%. Содержимое пробирок перемешивают путем одно-двукратного перевертывания их и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.

Трактовка результата:

Содержимое пробирок просматривают в проходящем свете.

Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.

Для этого каплю содержимого помещают на предметное стекло и просматривают под малым увеличением.

Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус-положительных эритроцитов и отсутствие с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в испытуемой сыворотке анти- D антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что антитела не выявлены.

Если антитела к антигенам эритроцитов выявлены, а специфичность их подтверждается в лаборатории, имеющей панель типированных эритроцитов, в антиглобулиновом тесте, то, зная их специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании крови специальным выбором донора. Если у больного выявлены антитела, но определить их специфичность невозможно, совместимость переливаний крови можно обеспечить индивидуальным подбором донора.

При обнаружении антител к антигенам эритроцитов выписывают ответ, который переносится в историю болезни.

Результаты исследования заносятся в регистрационный журнал с обязательным указанием серии, сроков вскрытия и сроков годности используемых реагентов.

Бланк ответа остается у больного, хранится в течение всей жизни и предъявляется при госпитализации.

Современным подходом к выполнению всего спектра иммуногематологических исследований является Гелевая технология. Метод основан на агглютинации эритроцитов в полиакриламидном геле, помещенном в микропробирки пластиковых диагностических карт. Гель может быть нейтральным, либо содержащим специфические моноклональные антитела или антиглобулиновый реагент.

Исследуемые эритроциты или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем диагностические карточки центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют осадок на дне микропробирки, в то время как агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля. Расположение агглютинатов в геле определяется силой агглютинации и положительный результат может быть оценен от 1+ до 4+. Размер частиц геля, специальный подбор моноклональных или поликлональных антител позволяет достичь наилучших результатов чувствительности и специфичности. А его прозрачность делает считывание результатов более надежными и позволяет интерпретировать самые сложные диагностические случаи.

Виды исследований, которые можно выполнить с помощью гелевой технологии:

· определение групп крови (прямая и двойная реакция)

· определение резус-принадлежности

· широкое типирование антигенов эритроцитов всех известных систем

· скрининг и идентификация аллоантиэритроцитарных антител

· диагностика аутосенсибилизации к антигенам эритроцитов

· индивидуальный подбор гемокомпонентов для переливания и пробы на совместимость

· диагностика посттрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных.

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик. Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты тестов могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для обучения в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод. Гелевый тест выполняется и оценивается по вышеприведенным правилам. Отсутствие этапов отмывание эритроцитов при выполнении непрямого антиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные данные.

5. Правила взятия крови у пациента и оформления документации.

Для иммуногематологических исследований кровь берется из вены в сухую чистую пробирку, на которой предварительно стеклографом (маркером) надписывается фамилия и инициалы пациента.

Количество зависит от объема исследований, но не менее 3-4 мл.

Сроки хранения крови перед исследованием: не более 72 часов при температуре +4-+8ºС.

С образцом крови в лабораторию передается направление, оформленное следующим образом:

Направление