Получение моноклональных антител

В 1975 году была описана методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител, как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии.

Рисунок 4. Получение моноклональных антител.

Для получения моноклональных антител изолируют В-лимфоциты из селезенки иммунизированной мыши и производят их слияние с опухолевыми клетками мыши (клетками миеломы). Это необходимо, так как жизнеспособность антителопродуцирующих лимфоцитов в культуре ограничена лишь несколькими неделями. При слиянии с опухолевой клеткой возникают гибридные клетки, так называемые гибридомы, которые являются потенциально бессмертными.

Слияние клеток является редким событием, частота которого повышается в присутствии полиэтиленгликоля [ПЭГ (PEG)]. Отбор продуктивных гибридных клеток проводится при длительной инкубации первичной культурыв ГАТ-среде(НАТ-среде), содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Поскольку дТМФ существенно необходим для синтеза ДНК, миеломные клетки не могут выживать в присутствии аминоптерина. С другой стороны, клетки селезенки могут преодолевать действие ингибитора, используя для синтеза ДНК гипоксантин и тимидин, однако и они существуют в течение ограниченного времени. Только гибридома выживает в виде культуры в среде ГАТ, так как эти клетки обладают одновременно бессмертием миеломных клеток и способностью клеток селезенки приспосабливаться к аминоптерину. В действительности продуцировать антитела способны только единичные гибридомные клетки. Такие клетки необходимо выделить и размножить клонированием. После тестирования клонов на способность образовывать антитела отбираются положительные культуры, которые снова клонируются и подвергаются последующей селекции. В результате получают гибридому, продуцирующую моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости мыши .

Одним из главных достоинств моноклональных антител является возможность их получения в неограниченном количестве при неизменных от партии к партии характеристиках. Благодаря этой особенности появилась возможность создания стандартных диагностических наборов реагентов для определения различных веществ.

Ферменты в ИФА

Второй составляющей метода ИФА является фермент конъюгированный с антителом или антигеном. Ферменты являются биокатализаторами, т.е. веществами биологического происхождения, ускоряющими химические реакции.

Ферменты способны повышать скорость катализируемой реакции в 10¹² раз и более. Ферменты специфически связывают реагенты (свои субстраты) в активном центре. При этом субстраты ориентируются таким образом, что приобретают оптимальное положение для образованияпереходного состояния. Сближение и необходимая ориентации реагентов значительно повышают вероятность образования продуктивного комплекса A—B. Кроме того, связывание субстрата в активном центре приводит к удалению гидратной оболочки субстрата. В результате удаления молекул водыв активном центре фермента во время катализа создаются совершенно другие условия, чем в растворе. Еще одним важным фактором является стабилизация переходного состояния вследствие взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом. Таким образом, переходное состояние в случае ферментативной реакции требует меньшей энергии активации. Кроме того, многие ферменты во время катализа переносят специфические группировки с субстрата или на субстрат. Особенно часто осуществляется перенос протонов.

Ферменты играют важную роль в биохимическом анализе. В биологических материалах, например в жидкостях организма, с помощью определения каталитической активности можно обнаружить ферменты в ничтожно малых концентрациях. При этом имеется возможность значительно снизить предел обнаружения ферментов за счет увеличения времени ферментативной реакции, а также за счет увеличения чувствительности регистрации продукта реакции. В связи с этим наиболее перспективными и широко применяемыми на практике методами детекции являются люминесцентные и методы, основанные на ферментативном усилении сигнала.

К ферментам, используемым в иммуноферментном анализе, предъявляется ряд требований:

- высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментную метку при низких концентрациях;

- доступность ферментов; возможность получения высокочистых ферментных препаратов, сохраняющих свою активность после модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами;

- стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;

- простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.

Существует достаточно большое количество ферментов удовлетворяющих эти требования и используемых в иммуноанализе. Однако, наибольшее распространение среди них нашли пероксидаза хрена, β-D-галактозидаза, уреаза и алкалиновая фосфатаза (табл 1). Характерной особенностью для всех этих ферментов является низкий предел обнаружения на уровне пикомолярных концентраций.

Фермент	Субстрат	Хромофор (краситель)	Буфер
HRP (пероксидаза хрена)	Перекись водорода (0,004%)	Ortho-phenylenediamine (OPD)	Фосфатно-цитратный, рН 5.0
Перекись водорода (0,004%)	Tetramethyl benzidine (TMB)	Ацетатный буфер, 0.1 M, pH 5.6
Перекись водорода (0,002%)	2,2'-Azino diethylbenzothiazoline sulfonic acid (ABTS)	Фосфатно-цитратный, pH 4.2
Перекись водорода (0,006%)	5-aminosalicylic acid (5-AS)	Фосфатный, 0.2 M, pH 6.8
Перекись водорода (0,002%)	Diaminobenzidine	Tris или PBS, pH 7.4
Алкалиновая фосфотаза	p-Nitrophenylphosphate (pnpp)	pnpp	Диэтаноламин (10 mM) и хлорид магния (0.5 mM), pН 9.5
-галактозидаза	o-nitrophenyl--D-galactopyranoside (ONPG)	ONPG	Хлорид магния и 2-меркаптоэтанол в PBS, pH 7.5
Уреаза	Мочевина	Бромокрезол	pH 4.8

Таблица 1. Основные ферментные системы, используемые при проведении ИФА

Пероксидаза хрена – глобулярный белок, молекулярная масса 40000. в состав активного центра молекулы пероксидазы входит феррипротопорфирин IX. Фермент катализирует в основном двухсубстратные реакции с участием перекиси водорода. В качестве второго субстрата могут выступать различные органические и неорганические вещества (например: люминол, анилины, замещенные фенолы). Реакция протекает в несколько стадий: на первой взаимодействие фермента с перекисью приводит к образованию промежуточной окисленной формы фермента (I), на второй стадии происходит восстановление окисленной формы вторым субстратом, являющимся донором водорода, с образованием второй промежуточной формы фермента (II). Затем вторая промежуточная форма фермента взаимодействует с еще одной молекулой второго субстрата, в результате чего фермент переходит в нативную форму (III).

Enz + H₂O₂ ↔ Enz₁

Enz₁ + суб-Н₂→ Enz₂ + суб-Н^-

Enz₂ + суб-Н₂→ Enz + суб-Н^-

2(суб-Н^-) → суб-Н₂ + суб

Для определения каталитической активности пероксидазы могут быть

использованы фотометрические, хемилюминесцентные, флуорометрические и электрохимические методы. Важной особенностью этого фермента является его полное отсутствие в крови.

Щелчная фосфотаза – молекула этого фермента является димером с ИФА.молекулярной массой 100 000. В состав каждой субъединицы входят два атома цинка, один из которых необходим для поддержания структурной целостности, а другой входит в состав активного центра фермента, обеспечивая его каталитическую активность. Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз различных ортофосфатных эфиров.

моноэфир ортофосфорной кислоты + Н₂О → спирт + РО₄^3-

Для определения каталитической активности этого фермента используют фотометрические и флуорометрические методы.

Глюкозооксидаза – фермент представляет собой гликопротеин, молекулярная масса 160 000, в состав входят две молекулы флавинадениндинуклеотида. Фермент катализирует окисление β-D-глюкозы кислородом с образованием перекиси водорода:

β-D-глюкоза + Н₂О + О₂ → Н₂О₂ + β-D-глюконо-σ-лактон.

Определение каталитической активности проводят по определению концентрации перекиси водорода с помощью пероксидазы хрена.