Материалы и методы исследований
Выделение лектинов из препарата «Ахлакор» проводили в следующей последовательности: 3 таблетки весом по 0,5 грамм тщательно растирали в фарфоровой ступке со стеклянным песком в ацетатном буфере рН 3,4 с 0,3 М NaCl. Гомогенат помещали в центрифужные стаканы, экстракцию проводили на холоду в течение 12 часов при периодическом перемешивании. Супернатант содержащий суммарный экстракт лектинов отделяли центрифугированием при 5 тыс. об/мин. При выделении лектиновых белков важен рН экстрагента. Он не должен превышать рН 4, т.к. при более высоких и тем более нейтральных рН выход лектинов очень низкий. В наших опытах белки, выделенные 0,14 – 0,6М NaCl без ацетатного буфера проявляли очень низкую агглютинирующую активность, хотя концентрация белка была весьма высокой. Вероятно в этих условиях выделяются альбумины, глобулины, ферментативные водо- и солерастворимые белки не лектиновой природы. Выделение препаратов лектинов из экстрактов осуществляли осаждением их холодным абсолютным этанолом. Осадок перерастворяли в фосфатном буфере рН 4,8 с 0,03M NaCl. Реакцию гемагглютинации ставили на иммунологических планшетах Такачи по общепринятой методике М.Д. Луцика и др[7]. В работе мы использовали эритроциты крови различных типов животных и птиц: кролика, быка, барана, голубя, гуся, петуха и все группы крови человека системы АВО. Для контрастирования реакции агглютинации использовали трипсинизированнные в 1% растворе трипсина эритроциты. Наиболее удачным тест – объектом в наших экспериментах оказались петушиные эритроциты. Титр агглютинации здесь составил 1:256. Из эритроцитов крови человека наибольшую активность с лектинами Ахлакора проявили эритроциты группы 0(I). Дальнейшую очистку лектиновых экстрактов проводили пропуская через колонку Sephadex G-25 элюируя их раствором 0,01 н HCl рН 4,0. Элюенты с сефадекса G-25 концентрировали упариванием и наносили на колонку с сефадексом G-75 для эксклюзионного фракционирования лектинов. После гель-фильтрации были выделены 3 хроматографических фракции белков, отличающиеся по молекулярной массе и геммагглютинирующей активности.
Первый пик элюировался с 12 – 40 пробирки объем его составлял 60 мл. Второй пик с 41 – 70 пробирки объем его составлял 93 мл. Третий пик элюировался 71 – 92 пробирки объем его составил 63 мл. Пики осаждали холодным абсолютным этанолом, перерастворяли 0,14 М NaCl и ставили реакции гемагглютинации.
Результаты исследований: Реакции гемагглютинации с хроматографическими пиками позволили выявить, что максимальную активность проявили лектины второго пика, где титр агглютинации составил 1:512 единиц. Первый и третий пики осаждали с титром 1:256. Интересно отметить, что лектины пика номер 2 проявляют большее сродство к эритроцитам крови группы АВ (IV) титр активности здесь составляет 1:1024 единиц. Интенсивность реакции лектинов прямо пропорциональна количеству связываемого белка и зависит от сродства лектинов к рецепторам локализованных на поверхности эритроцитарных мембран. Различная активность в связывании лектинами лекарственных трав с эритроцитами определенных групп крови свидетельствуют, что организм человека нуждается в лектинах определенной специфичности, подобно тому, что скорость протекания обменных реакции, генетические факторы, патологические процессы влияют и меняют соотносительную потребность организма в биологически активных соединениях.
Обсуждение полученных результатов:
БАД «Ахлакор» [10] разработана сотрудниками Института фитотерапии в качестве вспомогательного средства с целью повышения эффективности комплексного лечения хламидиоза. Данное заболевание относится к широко распространенным инфекционным болезням мочеполового тракта, слизистых оболочек глаз, суставов, органов дыхания и пр.[4,5,9]. Причиной болезни являются хламидии Chlamidia trachomatis, вызывающие патологию у человека. По разным данным, от 5 до 15 % молодых сексуально активных людей поражены хламидийной инфекцией. У пациентов дерматовенерологических диспансеров Российской Федерации данная инфекция встречается в 2—3 раза чаще, чем гонорея. Частота негонококковых воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы в 5—6 раз превышает таковую у гонореи, их инкубационный период более длительный, клинические проявления менее выражены, чаще возникают осложнения Выделено 15 серотипов, имеющих буквенное обозначение. Поражение мочеполового тракта вызывают серотипы Д – К. Хламидии имеют две стадии жизненного цикла – инфекционную (стадия элементарного тельца – ЭТ), адаптированную к внеклеточному существованию), и стадию ретикулярного, или инициального тельца (внутриклеточная неинфекционная стадия, очень лабильная). Микробиологические особенности Chlamydia trachomatis: внутриклеточное паразитирование — объединяет хламидии с вирусами, при этом хламидии не способны синтезировать АТФ и полностью зависят от энергетических ресурсов клетки — то есть в процессе паразитирования разрушают её полностью. Возбудитель имеет клеточную оболочку, что объединяет хламидии с бактериями и позволяет применять антибиотики для лечения хламидиоза [4,9].
Использование высокоэффективных и современных антибиотиков, химиопрепаратов, вакцин приводят к клиническому выздоровлению, но не полному исчезновению возбудителя из организма, что и определяет необходимость поисков новых средств, в том числе и среди представителей растительного мира. Доказана терапевтическая эффективность ряда лекарственных растений с противомикробной, противовоспалительной активностью [4,5,12].
Свойство растений к агглютинации было открыто в конце XIX века [8]. Но практические результаты в этой области биологии начали проводиться в 1970-1980-х годах. Тогда киевский биолог Е.Л. Голынская [1,2] в своей диссертационной работе начала изучать лектины лекарственных растений - белковые соединения, присущие всем живым организмам. Эти соединения на молекулярном уровне распознают возбудителей болезней. Евгения Львовна обратила внимание на то, что активность лектинов изменяется в зависимости от группы крови человека, принимающего лекарственные травы. В результате многолетних исследований Е.Л. Голынской было основано новое научное направление – изучение лектинов лекарственных растений как диагностических и фармакологически активных веществ, которое активно и целенаправленно развивается [1,5,6,10,11,]. Был разработан оригинальный лектинотест, где в качестве модели использовались отмытые эритроциты периферической крови [2]. Взаимодействуя с клетками, лектины обеспечивают проникновение в них полезных веществ, содержащихся в растениях. Таким образом, получается оздоровительный эффект. Улучшается обмен веществ в организме человека, повышается иммунитет, за счет чего больной выздоравливает.
Е.Л.Голынской [1.2] было сформулировано положение о функциональной гомологии между эндогенными лектинами организма человека и экзогенными лектинами, поступающими с пищевыми продуктами, в основе которой лежит идея лектинодефицита. Согласно данному подходу, наличие определенного запаса лектинов различной специфичности необходимо для поддержания нормальной жизнедеятельности, роста и воспроизведения организма. В свою очередь, изменение нормального уровня лектинов. либо дефицит лектинов определенного типа вследствие генетических причин, сужения пищевой базы, либо развития патологического процесса может оказать глубокое влияние на жизнеспособность организма. Это же известно и в отношении других биологически активных соединений, таких как, например, витаминов, гормонов [12].
Выводы: Биологическая активная добавка «Ахлакор», содержащая лектины 10 лекарственных растений, проявляет высокую гемагглютинирующую активность в отношении эритроцитов доноров всех 4 групп крови человека. Снабжение организма для создания определенного запаса лектинами различной специфичности необходимо для поддержания гомеостаза нормальных реакций дифференцировки, воспроизведения, а также для укрепления защитной силы организма. Это важно для лечения, профилактики и реабилитации хронических воспалительных заболеваний, в том числе и хламидиоза.
Литература
1. Голынская Е.Л. Лектины как действующее начало ряда лекарственных растений. – Первая респ. конф. по мед. ботан. – К.: Наукова думка, 1984 – С.104-105.
2. Голынская Е.Л., Погорелая Н.Ф., Макаренко В.И. Лектины как возможное фармакологически активное начало у некоторых лекарственных растений - Уч. зап. Тартуского ун-та. Вып. 870.- Тарту, 1989. – С.212-217.
3. Корсун В.Ф., Лахтин В.М., Корсун Е.В., Мицконас А.Фитолектины. – М., 2007. – 288 с.
4. Корсун В.Ф., Корс ун Е.В., Яговдик-Тележная Е.Н., Лучшев В.И., Погорельская Л.В. Лекарственные растения при инфекционных заболеваниях. – М.: Русский врач, 2008. – 246 с.
5. Корсун В.Ф., Корсун Е.В. Фитотерапия. Традиции российского травничества. – М., 2010. – 880 с.88 с.
6. Лахтин В.М. Лектины в исследовании углеводов: Автореф. д-ра биол. наук. М., 1991. – 49 с.
7. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д.Лектины. – Львов, 1981.
8. Осьмак А.А., Голынская Е.Л., Макаренко В.И. и др. Лектины лекарственных растений в иммунодиагностике и прогнозировании// Уч. зап. Тартуского ун-та. Вып. 870.- Тарту, 1989. – С. 217-222.
9. Особенности обнаружения и механизмы персистенции возбудителя Chlamydia trachomatis/ Н.Н. Полещук, Н.Н. Капитулец, Л.В. Рубаник, И.А. Варонько, И.П. Титова, Н.Ф. Сорока //Мед. новости. - 2003. - № 3. - С. 65-70.
10. ТУ 9197-007-93458068-12 на БАД «Ахлакор».
11. Ямалеева А.А., Юмагузина Х.А. Иммунохимический анализ лектинов пшеницы с различной устойчивостью к пыльной головне// Актуальные вопросы экологии Башкортостана. – 1992 г. С.70-72.
12. Ямалеева А.А. Лектины растений и их биологическая роль. - Уфа, 2001. – 203 с.
13. Ямалеева А.А., Хужина З.А., Чувилина.Фитотерапевтический эффект фитогемагглютининов Bupleurum aureum и Daucus sаtiva// VI Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» М., 2005.
14. Stilmark H. Ricin, ein giftiges Ferment aus den Samen von Ricinus communis und einigen anderen Euphorbaceaen. – Inaug, Dissertation. Dorpat, 1888.
15. Yamaleeva A.A. Lectin function in resustance of wheat to fungi diseasеs // 13th International Lectin Meeting. Interlec. B. – Berlin – 1991. – p. 67.
16. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Корсун В.Ф. Фитолектины и фитоферменты в биологии и медицине. – М., 2012. – 282 с
УДК