Глава 5. основы учения о вирусах

Вирусология — учение о вирусах. Им присущ строгий внутри­клеточный паразитизм, осуществляемый на молекулярно-генетическом уровне. Многие вирусные болезни животных (ящур, чума крупного рогатого скота, классическая и африканская чума сви­ней, оспа овец, ньюкаслская болезнь и ряд других) представляют большую опасность и приносят значительный экономический ущерб. (Классификацию вирусов см. в главе 1 раздела I).

Вирусы обладают свойствами, отличающими их от других микроорганизмов: они очень малы, способны проходить через бактериальные фильтры, не культивируются на искусственных питательных средах. Для вирусов характерны две формы сущест­вования: внеклеточная, или покоящаяся, внутриклеточная, или размножающаяся (комплекс вирус — клетка).

Вирусы имеют корпускулярную структуру и определенную для каждого вида морфологию. Величина их варьирует в широких пределах: возбудитель ящура размером до 30 нм, вирус коровьей оспы около 200 нм. Величину вируса определяют фильтрацией через фильтры с известной величиной пор, центрифугированием в скоростных центрифугах, что позволяет по скорости оседания судить о величине частиц, и, наконец, исследованием в элек­тронном микроскопе.

Инфекционные единицы вирусов называют вирионами. Каж­дый вирион состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной оболочками. Белковую оболочку называют капсидом. Структура, состоящая из нуклеиновой кислоты и окружающего ее капсида, именуется нуклеокапсидом. Различают два типа сим­метрии строения капсида: кубический и спиральный. У некото­рых вирусов капсиды окружены второй липо- или гликопротеидной оболочкой.

Нуклеиновая кислота несет в себе наследственные признаки, она непосредственно участвует в синтезе белка и, кроме того, является фактором инфекционности вируса, а белок обеспечивает антигенную специфичность и стимулирует образование антител.

При ряде вирусных болезней (оспа, бешенство) обнаруживают внутриклеточные тельца-включения (элементарные тельца), что имеет диагностическое значение. По составу они разнообразны, но в большинстве своем состоят из вирусных частиц.

Очистка и концентрация вирусов.Достигаются путем фильтра­ции через специальные фильтры с использованием синтетичес­ких смол и полимерных материалов, а также путем ультраско­ростного центрифугирования. Эти методы позволяют также вы­делить отдельные компоненты (фракции) вирусов.

Устойчивость вирусов.К воздействию факторов внешней среды и разного рода физических факторов и химических веществ ус­тойчивость вирусов различна и зависит от их строения и химичес­кого состава, наличия защитных оболочек, среды, в которой нахо­дится вирус. Степень устойчивости соответствует механизму пере­дачи вируса. Наиболее устойчивы вирусы, которые передаются алиментарным путем (классическая чума свиней, ящур) или через наружные покровы (контагиозный пустулезный дерматит овец и коз). Менее устойчивы вирусы, передающиеся воздушно-капель­ным (респираторным) или трансмиссивным путем.

Культивирование вирусов.Для размножения вирусов необхо­димо наличие живых чувствительных к нему клеток. Поэтому культивирование вирусов осуществляют в организме восприим­чивых животных, в клетках куриных эмбрионов и клетках куль­тур тканей.

В клетку проникает нуклеиновая кислота вируса. В соответст­вии с заложенной в ней генетической информацией живая клет­ка начинает производить ферментные системы, а затем белковые компоненты и нуклеиновую кислоту возбудителя. После этого происходит «сборка» составных частей вируса из белковых моле­кул и нуклеиновой кислоты. Накопление вирусных частиц при­водит, как правило, к разрушению клетки и выделению вирионов во внешнюю среду.

Различают два типа клеточных культур: 1) клетки куль­тур переживающих тканей (первично трипсинизированные) получают путем механического (измельчение) и фермента­тивного (трипсинизация) расщепления тканей из почек живот­ных, плаценты, сердца, куриных эмбрионов (фибробласты куриного эмбриона); 2) клетки культур растущих тка­ней (перевиваемые) получают чаще всего из злокачественных опухолей. Используют также культуры диплоидных клеток, которые не опасны в канцерогенном отношении.

Выращивание культур клеток чаще производят в однослойных (монослойных) культурах. В этом случае клетки, внесенные в стеклянный сосуд, прикрепляются к одной из его стенок, обра­зуя слой толщиной в одну клетку. Модификации этого метода — выращивание культур клеток во вращающихся сосудах (роллерный метод), на пластинках, помещенных в сосуд, на микроноси­теле (гранулы полимерных материалов, на поверхности которых образуется монослой клеток). Большинство вирусов по мере роста в однослойных культурах вызывают дегенерацию и гибель клеток, что называют цитопатогенным действием (ЦПД). Таким свойством обладают вирусы ящура, ньюкаслской болезни. Спе­цифичность ЦПД устанавливают с помощью реакции нейтрали­зации со специфической сывороткой. Однако имеются вирусы, которые размножаются без проявления ЦПД (вирус классичес­кой чумы свиней). Существует также метод глубинного выращивания вирусов, при котором клетки находятся во взвешенном состоянии (в перемешиваемых суспензиях). Рост культур клеток и размножение вирусов происходят в питатель­ных средах, содержащих аминокислоты, витамины, соли, глюко­зу, сыворотку и другие вещества.

Патогенное действие вирусов.Действие вирусов на организм животного сопровождается поражением чувствительных клеток, местными и общими реакциями. На месте размножения вируса наблюдают распад клеток (например, слущивание эпителия), что зачастую сопровождается внедрением бактериальной флоры и накоплением различных токсических веществ, всасывание кото­рых приводит к повышению температуры тела, нарушению обме­на веществ. Специфичность действия вирусов связана с избира­тельным поражением определенных органов и тканей — тропиз­мом. Вирус ящура, например, поражает в основном эпителиальные ткани, а бешенства — нервную ткань.

Общие реакции проявляются, прежде всего, повышением тем­пературы тела, угнетением, отказом от корма. Отмечают также изменение форменных элементов крови и ее состава, образова­ние антител, нарушение деятельности сердечно-сосудистой, ды­хательной, пищеварительной систем, возникновение патологоанатомических изменений (воспалительные процессы лимфоидной ткани и др.).

Установлена возможность длительного вирусоносительства. Примером может служить вирус герпеса, патогенное действие которого проявляется лишь на фоне ослабления резистентности организма. Некоторые вирусы (вирус классической чумы свиней) могут также длительно находиться в организме переболевшего животного.

(Иммунитет при вирусных болезнях см. в главе 2 раздела II.)

Вирусологическое исследование.Это комплекс лабораторных исследований, направленных на распознавание этиологии болез­ни, выделение и изучение вируса-возбудителя, а также на обна­ружение в крови больных и переболевших животных специфи­ческих антител.

Выделение вируса зависит от правильности взятия и хранения материала. Вирус выделяют путем заражения лабораторных жи­вотных, развивающихся куриных эмбрионов или культуры тка­ней. С целью дальнейшего изучения вирусы культивируют на чувствительных объектах. Изучают биологические свойства выде­ленного вируса: устойчивость к воздействию разных температур, красителей, лучистой энергии, рН среды, течение болезни у лабораторных животных. В реакциях связывания комплемента, нейтрализации, иммунофлюоресценции, гемагглютинации и за­держки гемагглютинации, преципитации и др. определяют анти­генные свойства выделенного вируса. Некоторые из этих реак­ций используют и для определения наличия антител в крови животных по заведомо известному вирусному антигену. По ком­плексу признаков, присущих выделенному вирусу, производят его идентификацию, т.е. устанавливают принадлежность к опре­деленному виду. Совокупность данных эпизоотологических, кли­нических, патологоморфологических, вирусологических и серо­логических исследований позволяет поставить диагноз при воз­никновении болезни вирусной этиологии.

Лабораторная работа.

Техника заражения куриных эмбрионов и культуры фибробластов

Заражение куриных эмбрионов.Проводят с диагностической целью для обнаружения и идентификации вирусов, а в био­логической промышленности — для изготовления вакцин и антигенов. Берут свежие оплодотворенные инкубированные при 38 °С яйца, овоскопируют (просвечивают) их в темной ком­нате, чтобы выявить неоплодотворенные яйца и отличить живые эмбрионы от погибших. Неоплодотворенные яйца про­зрачны. В оплодотворенных инкубированных яйцах обнаружи­вают движение эмбрионов и наполнение кровью сосудов хорион-аллантоисной оболочки.

Рис. 10. Заражение куриных эмбрионов в аллантоис­ную полость: 1 — желточный мешок; 2 и 4 — хорион-аллантоисная по­лость; 3 — воздушная камера; 5 — зародыш; 6 — белок

Отбирают яйца с живыми эмбрионами, отмечают простым карандашом границу пуги — воздушного пространства со сто­роны тупого конца яйца — и заражают вируссодержащим ма­териалом (органы и ткани больных животных и т.п.). Ма­териал предварительно растирают в ступке, суспендируют в мясо-пептонном бульоне (1:10), фильтруют через 3-4 слоя марли, добавляют растворы антибиотиков (100-200 ЕД пени­циллина и 100-150 ЕД стрептомицина на 1 мл суспензии). Заражают эмбрионы в стерильных условиях — в боксе, который представляет собой специальную комнату с остекленными перегородками. Предва­рительно бокс дезинфицируют: распыля­ют 5%-ный раствор фенола, после чего включают бактерицидные лампы на 30-40 мин. Заражают эмбрионы чаще в аллантоисную полость. Скорлупу со сторо­ны пуги дезинфицируют спиртом или обжигают спиртовым ватным тампоном, смазывают 5%-ным раствором йода, сте­рильной иглой со шприцем вводят в аллантоисную полость вируссодержащий материал (рис. 10). Заливают отверстие расплавленным парафином или заклеива­ют пластырем.

Зараженные эмбрионы инкубируют при 36-37,5 °С. Сюда же ставят кювету с водой для поддержания влажности. Сроки инкубирования зависят от характера виру­са. Изменения можно обнаружить уже через 48-96 ч. Эмбрионы ежедневно осматривают, овоскопируют, поворачивают каждый раз другой стороной; погибшие вскрывают или сохраняют при 4 °С.

Вскрытие погибших эмбрионов.Скорлупу дезинфицируют спиртом и настойкой йода и срезают ножницами по границе пуги. Разрезают скорлуповую и хорион-аллантоисную оболочки; стерильной пастеровской пипеткой отсасывают в пробирку аллантоисную жидкость; содержимое яйца выливают в чашку Петри и изучают изменения. Чаще обнаруживают в хорион-аллантоисной оболочке воспалительные очаги и кровоизлияния в теле эмбриона.

Культивирование клеток куриных фибробластов (КФ) и тех­ника их заражения.Культуру КФ готовят на основе фермен­тативного гидролизата мышц (ФГМС) или на другом гидролизате. Берут 9-10-дневный куриный эмбрион, тупой конец яйца протирают спиртом и прожигают. Верхнюю часть скор­лупы по окружности вскрывают ножницами и пинцетом из­влекают эмбрион на чашку Петри. Голову и лапки удаляют, тушку переносят в мерный стаканчик, разрезают ножницами на кусочки 2-3 мм величиной, промывают дважды раствором Хенкса (1:20), встряхивая при этом содержимое. Надосадочную жидкость сливают. Ткань заливают в соотношении 1:10 подо­гретым до 35 °С раствором трипсина и переливают в кони­ческую колбу, куда опускают простерилизованный кипячением цилиндрический магнитик (входит в комплект магнитной ме­шалки), и 25-30 мин перемешивают содержимое с такой скоростью, чтобы на поверхности жидкости образовывалось воронкообразное углубление. Клеточную взвесь, состоящую уже из одиночных клеток, фильтруют через марлю и разводят в 2 раза свежеприготовленной ростовой средой: 0,25%-ный рас­твор ФГМС на растворе Эрла — 90% и сыворотка крупного рогатого скота — 10%. Определяют концентрацию клеток в 1 мл взвеси, пользуясь камерой Горяева. Исходя из расчета, суспензию разводят ростовой средой до концентрации 700-800 тыс. клеток в 1 мл и высевают по 1 мл в пробирки с резиновыми пробками. Их размещают в наклонном положении в термостате при 37 °С. Через 24-48 ч в пробирках форми­руется плотный слой (монослой), состоящий из прозрачных фибробластоподобных клеток, толщиной в одну клетку.

Заражают культуру КФ суспензией патологического материала в растворе Хенкса (1:10) с добавлением пенициллина и стрепто­мицина по 1000 ЕД на 1 мл. Из приготовленных пробирок с культурами клеток сливают ростовую среду, вносят в них по 1 мл тканевой суспензии.. Чтобы вирус адсорбировался на клетках, пробирки ставят в термостат на 30 мин, затем исследуемый ма­териал сливают, культуры в пробирках ополаскивают раствором Хенкса в объеме 1 мл, затем заливают таким же объемом свежей ростовой среды и вновь помещают в термостат. Просматривают культуры под микроскопом через каждые 24 ч., сравнивая с незараженными культурами. По мере необходимости меняют пита­тельную среду на свежую. ЦПД проявляется в зависимости от характера вируса на 1-3-и сутки, иногда и в более поздние сроки.

Контрольные вопросы. 1. Чем отличаются вирусы от бактерий? 2. Как культи­вируют вирусы? 3. Каковы методы выделения и идентификации вирусов? 4. Что вы знаете о технике заражения куриных эмбрионов вируссодержащим материа­лом?