Краски и их приготовление
Все употребляемые в гистологии краски по сродству их к тем или иным тканевым элементам делятся на ядерные (основные) и диффузные (кислые). Каждая группа насчитывает значительное количество красящих средств. В условиях работы патологогистологического отделения нет надобности во всей массе имеющихся красок. Для подавляющей части диагностических исследований достаточны такие простые способы окраски, как гематоксилин-эозин и по Ван-Гизону, и несколько специальных методов (фосфорно-вольфрамовый гематоксилин, судан-III, конго-рот и т. д).
Основные, или ядерные краски.
В этой группе наибольшее значение имеют красители, приготовленные из гематоксилина.
Гематоксилин является экстрактом кампешевого дерева, имеет вид бурого кристаллического порошка, хорошо растворимого в спирте и плохо в воде. Существует много способов приготовления гематоксилина, но суть их одна – его окисление.
Красящим веществом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления – гематеин (C16H1406). В связи с этим часть гематоксилиновых красок пригодно для работы не сразу после приготовления, а только по истечении некоторого времени, в течение которого происходит окисление гематоксилина в гетеин, что обозначается как «созревание краски». По мере созревания краски возрастает её красящая способность. Созревания требуют только те гематоксилиновые краски, которые готовят без окислителей.
Из квасцовых гематоксилинов, приготовляемых с окислителями и потому сразу окрашивающих, используется гематоксилин Караци и железный гематоксилин Вейгерта.
Гематоксилин Караци имеет следующий состав:
Вода дистиллированная – 400мл
Квасцы алюмо-калиевые – 25 г
Гематоксилин кристаллический – 0,5 г
Глицерин – 100 мл
Йодноватокислый калий – 0,03 г
Смесь готовят при комнатной температуре. Вначале она представляет собой светло-фиолетовую прозрачную жидкость, которая через несколько часов становится темно-вишневой и непрозрачной; с этого момента она начинает окрашивать срезы, необходимое время окрашивания – 20-40 минут. В последующие дни красящая способность нарастает спустя 1-2 недели хорошие результаты будут уже через 10-15 минут. В дальнейшем, по мере созревания, краситель может и перекрашивать.
Красящий раствор обладает большой устойчивостью, сохраняется около 10 лет; в первые недели после приготовления можно не фильтровать. Для предупреждения плесени в краску добавляют несколько кристалликов тимола.
Железный гематоксилин Вейгерта (Ван-Гизон) приготавливают из двух основных растворов (Вейгерт 1 и Вейгерт 2) только по мере надобности.
Раствор Вейгерт 1 представляет собой 1 % раствор гематоксилина в 960 спирте (на 100 мл 1 г).
Раствор Вейгерт 2 имеет следующий состав: 4 мл крепкой хлористоводородной кислоты и добавляют 95 мл дистиллированной воды.
Этот раствор желательно готовить на срок не более 3-4 месяцев.
Перед употреблением смешивают точно поровну оба раствора в маленьком градуированном цилиндре; получается густая темно-фиолетовая смесь. Свежеприготовленная смесь обладает высокой красящей способностью, интенсивно окрашивает срезы в течение 3-5 минут. Правильно приготовленный раствор железного гематоксилина должен отличаться известной стойкостью и не изменять цвета около 40-60 минут. В последующие часы такая краска становиться тёмно-вишнёвой с коричневым оттенком, а со 2-3-го дня постепенно буреет, сохраняя этот цвет несколько недель. Лучше всего пользоваться смесью сразу после приготовления, однако если она была хорошо приготовлена, то, несмотря на бурение, её с большим успехом можно использовать повторно, не прибегая к фильтрованию еще 1-2 недели.
Краска, в которой появился хлопьевидный осадок, негодная для повторного употребления.
Если свежеприготовленная краска начинает буреть и приобретать зеленоватый оттенок сразу или вскоре после приготовления (в течение 5-10-20 минут), то она считается негодной, ибо приводит в дальнейшем и бурой и зеленоватой окраске ядер, в то время как нормально они должны быть черными. Такое преждевременное побурение и позеленение краски обычно связано с преобладанием в смеси второго раствора (Вейгерт 2).
Следует помнить, что при смешивании по каплям таких растворов, как Вейгерт 1 и 2, для получения равных объемных отношений необходимо брать первого раствора в 2 раза больше капель, чем второго. Например, на 2 капли второго – нужно взять 5 капель первого раствора. Это объясняется разницей поверхностных натяжений этих растворов (один – спиртовой, другой – водный), в силу чего капли их неодинаковы по объему. Понятно, что пипетки для них должны быть одинаковыми. Можно пользоваться и одной пипеткой, но тогда, перед тем как набирать краску, пипетку каждый раз надо тщательно промывать в дистиллированной воде.
Все гематоксилиновые красители окрашивают ядра в темно-синий (квацевые) или черный (железный гематоксилин) цвет.
Кислые краски. Из диффузных красок постоянное применение имеют эозин, кислый фуксин и пикриновая кислота. Последние две краски употребляются в специальной смеси друг с другом, называемой пикрофуксином или смесью Ван-Гизона.
Эозин – синтетический краситель, тетерабрампроизводное флуоресцина.
Выделяется в виде натриевой, калиевой или аммониевой соли. Различают много сортов эозина, из них наибольшее распространение имеют: эозин желтый (растворимый вводе), голубоватый (растворимый в спирте), эритрозин (растворимый только в спирте). Употребляются эозины в 0,25-0,5% водных или спиртовых растворах. Для приготовления спиртовых растворов можно пользоваться любыми сортами эозина и брать спирт различной крепости (от 40° до 70°); они окрашивают сильнее водных. Иногда пользуются растворами эозина, подкисленными уксусной кислотой, примерно из расчета 1 капля крепкой уксусной кислоты на 100 л раствора эозина. Подкислять лучше спиртовые растворы эозина, так как водные (подкисленные) с течением времени могут мутнеть и давать осадки. Такие подкисленные растворы показаны в том случае, когда ткани плохо воспринимают обычный (неподкисленный) краситель.
Растворы эозина розового цвета, в такой же цвет они окрашивают и ткани. Сроки окрашивания весьма различны (от 5-10 секунд до 3-5 минут) и зависят от сорта, способа приготовления и процентного содержания красителя.
Пикрофуксин. Готовят из насыщенного при комнатной температуре водного раствора пикриновой кислоты и 1 % водного раствора кислого (не основного) фуксина (при комнатной температуре в 100 мл дистиллированной воды растворяется около 12 г пикриновой кислоты).
Оба раствора смешивают из расчета 10 мл пикриновой кислоты на 1 мл фуксина. Получается жидкость гранатового цвета. Особенностью этой смеси является то, что разные ткани она окрашивает различно и этим значительно облегчает их исследование. Каждая ткань воспринимает из этой смеси только одну составную часть краски и именно ту, которая обладает наибольшим сродством к ней. Так, соединительная ткань лучше всего воспринимает кислый фуксин и потому окрашивается в ярко-красный цвет. Мышечная ткань (поперечнополосатая и гладкая), эластические волокна окрашиваются пикриновой кислотой в желтый цвет и цитоплазма различных клеток. Данное обстоятельство имеет весьма важное дифференциально-диагностическое значение, и в этом большое преимущество пикрофуксина перед эозином, одинаково закрашивающим все ткани.
Пикрофуксин требует тщательного приготовления. Помимо точного соблюдения соотношений указанных компонентов, краску иногда приходится подгонять по контрольным препаратам, добавляя в неё то одну, то другую составную часть. Так, если преобладает фуксин, то доливают пикриновую кислоту и наоборот. Правильно приготовленная краска отличается тем, что её составные части дают на тканях, к которым они обладают небольшим сродством, лишь свой совершенно чистый тон и не забивают друг друга.
Все краски для гистологических работ готовят обязательно на дистиллированной воде.
Способы окрасок
В гистологической технике в зависимости от числа применяемых красящих средств различают следующие виды окрасок:
– простую (применяется одна краска),
– двойную (две краски)
– тройную, или сложную (три краски).
Во всех этих окрасках главная роль принадлежит ядерной (основной) краске, которая употребляется либо одна, либо в комбинации с кислыми (одной или несколькими).
Наиболее распространены комбинированные окраски, здесь возможны самые разнообразные сочетания. В патологогистологической практике широко применяются гематоксилин в комбинации с эозином (двойная) и гематоксилин с пикрофуксином (тройная). Последняя окраска известна под именем Ван-Гизона.
Окрашивание препаратов в обоих случаях идет по одной и той же схеме и состоит в последовательном применении сначала ядерной, а затем кислой краски с промыванием в воде после каждой из них.
Также существуют и другие типы окрашивания:
Прогрессивное окрашивание – способ, при котором срезы находятся в красителе до тех пор, пока не достигнут требуемого уровня окрашиваемости.
Регрессивное – срезы вначале перекрашивают, а затем доводят до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо выделить отдельные элементы тканей.
Следует постоянно помнить:
а) о тщательном удалении отмывающей жидкости (в противном случае она будет продолжать действовать и исказит результат окраски);
б) о предпочтительном применении тонких срезов;
в) о том, что разведенные красители дают лучшие результаты, чем крепкие растворы (толстые срезы и высокая концентрация красителя затрудняют дифференцировку и приводят к неравномерной окраске срезов);
г) окраску нужно проводить под контролем микроскопа.
Прямое окрашивание – окрашивание объекта непосредственно в растворе красителя;
Непрямое (протравная) – срез окрашивают нужным красителем лишь после предварительной обработки специальными протравными красителями.
Все методы гистологического окрашивания можно разделить на две основные группы:
а) обзорные, используемые для получения общего ориентировочного представления об изучаемом объекте (окрашиваются преимущественно ядра и цитоплазма клеток);
б) специальные, которые позволяют окрашивать именно те тканевые и клеточные элементы, которые интересуют исследователя.
Для того чтобы получить хорошие результаты при любом методе окраски гистологических препаратов, необходимо соблюдать определенные правила:
1. Красящие растворы должны быть чистыми, поэтому любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде;
2. Отдавать предпочтение: а) окрашиванию красителями низкой концентрации в течение длительного времени перед кратковременной окраской красителями высокой концентрации;
б) применению регрессивных методов.
Тщательно выполнять все процедуры при подготовке среза к окраске и последующей его обработке.