Г. Иммуногистологические исследования.

Д. Иммуногенетические исследования:HLA-типирование с помощью серологической и молекулярно-биологической технологии, фенотипическое и генотипическое определение аллотипов сывороточных белков, пренатальная диагностика и наследование генетически детерминированных дефектов иммунной системы.

В реальной практике для оценки иммунного статуса выполняется первичный скрининг иммунной системы и постановка тестов для уточнения характера иммунных нарушений. Набор методов для первичного скрининга иммунной системы (тесты 1-го уровня) обычно включает определение популяций и субпопуляций лимфоцитов по кластерам дифференцировки (CD-3 – Т-лимфоциты, CD-4 – Т-хелперы, CD-8 – цитотоксические Т-киллеры/супрессоры, CD-16 – естественные киллеры, CD-19 – В-клетки и т.д.) методами цитофотометрии или иммунофлюоресцентного анализа, определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G с помощью метода радиальной иммунодиффузии по Манчини или нефелометрическими методами, уровня циркулирующих иммунных комплексов спектрофотометрическим методом, показателей фагоцитоза. Эти исследования позволяют выявить нарушения в основных звеньях иммунитета (гуморальном, клеточном, фагоцитарном). Уточняющие методы (тесты 2-го уровня), требующие специальной аппаратуры, реактивов и обученного персонала, позволяют оценить функции клеток иммунной системы, вспомогательных клеток, продукцию цитокинов и т.д. Для объективизации и стандартизации данных иммунологических исследований используется специальная аппаратура (иммуноферментные анализаторы, спектрофотометры и фотоэлектроколориметры, счетчики радиоактивности, лазерные нефелометры и проточные цитофлюориметры, хемилюминометры).

Преимущества иммунологических методов заключаются в том, что эти методы весьма чувствительны и специфичны.

Студенты знакомятся с основными методами оценки иммунного статуса организма человека в демонстрации.

1. Определение популяций и субпопуляций лимфоцитов с помощью иммунофлюоресцентного метода (демонстрация).Лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови центрифугированием на градиенте фиколл-верографина (плотность 1,077 г/мл). 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в центрифужные пробирки или лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD-3 – Т-лимфоциты, CD-4 – Т-хелперы, CD-8 – цитотоксические Т-киллеры/супрессоры, CD-19 – В-клетки) и инкубируют 30-45 мин при +4⁰ С. Затем клетки дважды отмывают на центрифуге при 1200 об/мин в течение 5 мин, супернатант удаляют. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab')2 -фрагментов овечьих антител к Ig мыши в разведении 1:100, меченых флюоресцеином. Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4⁰ С. После этого клетки 2 раза отмывают на центрифуге, добавляют 50 мкл 1% параформальдегида (или формалина в разведении 1:40), суспендируют и анализируют на проточном цитофлюориметре или просматривают с помощью флуоресцентного микроскопа, определяя процент флуоресцирующих клеток. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, однако вместо моноклональных антител клетки обрабатывают раствором Хенкса или нормальным Ig мыши.

Определение количества лимфоцитов разных популяций и субпопуляций по поверхностным маркерам проводится также с по­мощью автоматического подсчета клеток с использованием специального прибора - про­точного цитофлюориметра. Для этого образец цельной крови инкубируют с моноклональными антителами, меченными флюоресцентным красителем, пропускают через тонкую трубочку, на выходе из которой формируется струя из капель, содержащих только одну клетку, проходящую перед лазерным лучом. При попадании лазерного луча в клетку происходит его отклонение, а также свечение поверхностного антигена клетки в результате его соединения с соответствующим флюоресцирующим моноклональным антителом. Фотоумножитель проточного цитофлюориметра регистрирует оба сигнала, при этом светорассеяние дает информацию о размерах и гранулярности клетки, а флюоресценция - о количестве связанных клеткой меченых антител, позволяя судить об экспрессии поверхностных маркеров. При исполь­зования двух разных моноклональных антител, конъюгированных с разными флюорохромами (например, флюоресцеина, дающего зеле­ное свечение, и фикоэритрина, обладающего красным свечением), клетки оцениваются по интенсивности зеленого и красного типов флюоресценции.

2. Методы оценки функций лимфоцитов (демонстрация). Функциональную полноценность Т-лимфоцитов косвенно оценивают с помо­щью кожных проб, отражающих интенсивность реакций ГЗТ в отношении распространенных микробных аллергенов (кандидозного, стрептококковых, туберкулина и т.д.). Аллерген вводят внутрикожно и через 48 ч измеряют диаметр инфильт­рата — уплотнения, отражающего интенсивность реакции ГЗТ.

Одной из функций лимфоцитов является их пролиферация в ответ на действие антигенов – индукторов пролиферации - так называемых неспецифических поликлональных митогенов. Для Т-лимфоцитов распространенным поликлональными митогенами является фитогемагглютинин, полученный из бобов расте­ний), для В-лимфоцитов — компоненты бактерий (липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий, А-протеин стафилококка и т.д.). Для количественной оценки пролиферации клеток обычно исследуют включение радиоактивной метки (Н3-тимидина) в ДНК клеток как показатель их пролиферации. Этот тест пролиферативной активности лимфоцитов называется реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).

Другой подход к оценке функций Т-лимфоцитов заключа­ется в измерении их способности продуцировать цитокины, появляющиеся при активации Т-лимфоцитов антигенами (митогенами). Определение ти­пов цитокинов и их количества в культуральной среде Т-лим­фоцитов позволяет оценить функциональную активность кле­ток. Количество цитокинов определяют по их биологической активности или с помощью ИФА.

Функции В-лимфоцитов косвенно оценивают по уровням иммуноглобулинов, изогемагглютининов и нормальных антибактериальных антител в сыворотке крови.

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ – демонстрация). Реакция основана на способности лимфоцитов после повтор­ного контакта с антигеном, к которому они были ранее сенсибилизированы, продуцировать лимфокины, влияющих на миграцию гранулоцитов, моноцитов, макрофагов. РТМЛ периферической крови в присутствии причинного антигена позволяет выявить специ­фическую сенсибилизацию Т-лимфоцитов. РТМЛ ставят в ка­пиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейко­цитов крови в присутствии и в отсутствие причинного мик­робного антигена, после чего измеряют зоны миграции (в про­центах) в присутствии антигена по сравнению с контролем, принятым за 100 %. В случае выявления сенсибилизации к антигену на­блюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже 100 %).

2. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови человека методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (демонстрация). В 3 пробирки с расплавленным и остуженным до 50⁰ С агаром вносят соответственно сыворотки против иммуноглобулинов человека классов М, А, G. Содержимое пробирок разливают на 3 стек­лянных или пластиковых пластины. После застывания агара в нем на расстоянии 1 см друг от друга вырезают лунки. В лунки вно­сятся исследуемые и эталонные сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов. Иммуноглобулины исследуемых сы­вороток диффундируют в агар и образуют зону преципитации вокруг лунки, взаимодействуя с антителами, находящимися в агаре. Измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки и сравнивают с диаметром кольца преципитации эталонной сыворот­ки. Используя калибровочную кривую или специальную компьютерную программу, определяют уровень иммуноглобулинов в сыворотке в г/л.

3. Оценка фагоцитарного звена иммунитета (демонстрация).Цитратную кровь или лейкоцитарную взвесь инкубируют с бактериями или другими объектами (частицы латекса, дрожжи и т.д.) в течение 30 минут, после чего готовят мазок, окрашивают по методу Романовского-Гимза и микроскопируют. Подсчитывают 100 клеток для определения процента фагоцитирующих клеток (в норме 40-80%) и количества бактерий захваченных 1 фагоцитирующей клеткой (в норме – 1-5).

Кроме того оценивают интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах (косвенный показатель бактерицидности) по способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме фагоцитов глыбок темно-синего формазана. Чем ак­тивнее окислительный взрыв в фагоцитах, тем большая доля клеток содержит осадок формазана. После подсчета клеток доля формазан-положительных выражается в процентах. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц только с красителем без индуктора окислительного взрыва доля формазан-положительных клеток не превышает 1—2 %. Инкубация лейкоцитов здоровых лиц с индуктором окислительного взрыва (объекты фагоцитоза, бактериальные полисахариды) приводит к окислительному взрыву всех 100 % фагоцитов и накоплением осадка формазана. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о де­фектности кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов.

2. Титрование комплемента сыворотки крови (демонстрация). Метод основан на феномене комплементзависимого лизиса нагружен­ных антителами эритроцитов барана. За единицу активности комплемента принимается такое его количество, которое вызывает гемолиз 50 % сенсибилизированных эритроцитов (СН50).

В пробирку с сывороткой крови в разведении 1:10 добавля­ют гемолитическую систему (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой кролика), ин­кубируют 45 минут при 37⁰ С, сохранившиеся эритроциты осаждают цент­рифугированием. Интенсивность гемолиза регистрируют с помощью спектрофо­тометра или фотоэлектроколориметра. У здоровых людей титр комплемента составляет 40—80 СН50 на 1 мл.

Титрование комплемента по 50 % гемолизу не позволяет судить о состоянии отдельных компонентов системы компле­мента. В настоящее время выпускаются иммуноферментные тест-системы для определения отдельных компонентов системы комплемента.

В последние годы налажен выпуск иммуноферментных систем для определения различных цитокинов. Исследование уровня цитокинов при различных патологических состояниях дает ценную информацию для диагностики ряда болезней и назначения обоснованного лечения.

Оценка иммунного статуса организма человека при различных патологических состояниях имеет важное практическое значение для диагностики, лечения, прогнозирования, оценки эффективности проводимой терапии при многих заболеваниях. Показатели иммунограммы здорового человека представлены в таблице 12.

Таблица 12

Показатели иммунограммы здорового человека

Показатели	Норма	Показатели	Норма
Лейкоциты кл/л	3500-8500	CD-11B %%	15-27
Лимфоциты %%	25-35	CD-11B кл/л	300-540
Лимфоциты кл/л	1600-2400	CD-16 (NК—клетки) %%	9-16
Моноциты %%	3-10	CD-16 (NК—клетки) кл/л	200-400
Моноциты кл/л	90-300	СD-19 (В-лимфоциты) %%	10-16
Нейтрофилы с/я %%	50-65	СD-19 (В-лимфоциты) кл/л	100-400
Нейтрофилы с/я кл/л	2000-4000	CD-25 %% (рецептор к ИЛ-2)
Палочкоядерн.%%	1-4	CD-25 кл/л (рецептор к ИЛ-2)
Палочкоядерн. кл/л	40-300	СD НLА-DR %%	7-18
Юные %%		СD НLА-DR кл/л	300-600
Юные кл/л		CD-95 %% (рецептор апоптоза)	41-63
Эозинофилы %%	1-4	CD-95 кл/л	820-1260
Эозинофилы кл/л	20-300	ЦИК усл.ед.	18-45
Базофилы %%	0-1	СОЭ	1-15
Базофилы кл/л	0-70	IgG г/л	9,0-16,0 г/л
СD-3 (Т-лимфоциты) %%	50-76	IgM г/л	0,7-1,5 г/л
СD-3 (Т- лимфоциты) кл/л	1000-2200	IgА г/л	1,0-2,5 г/л
СD-4 (Т-хелперы) %%	30-46	IgЕ г/л	0-150МЕ/мл
СD-4 (Т-хелперы) кл/л	500-1000	Фагоцитарная активность %%	50-74
СD-8 (Т-киллеры/супрессоры) %%	26-40	Фагоцитарный показатель	5-9
СD-8 (Т-киллеры/супрессоры) кл/л	400-800	ХЛ фагоцитов спонтанная	1,0-1,8
СD-4/СD-8 (ИРИ)	1,0-1,6	ХЛ стимулированная	3-12

Примечание: ХЛ- хемилюминесценция нейтрофилов (спонтанная, стимулированная)