Учтите и оцените результаты непрямой гемагглютинации (РНГА или РПГА).
Леч., пед ф-ты 2006
ЗАНЯТИЕ 10
Тема: Реакции иммунитета: реакция агглютинации, реакция преципитации.
Цель: Изучить реакции иммунитета: реакцию агглютинации (РА), реакцию преципитации (РП).
Знать:
1. Понятие иммунитет, его виды.
2. Антигены, их свойства; антигены микробной клетки.
3. Антитела, их свойства.
4. Сущность серологических реакций, их виды и практическое использование.
Уметь:
1. Поставить, учесть и оценить результаты РА на стекле, РА в развернутом ряду.
2. Учесть и оценить результаты РНГА.
3. Поставить, учесть и оценить реакцию кольцепреципитации по Асколи.
4. Учесть и оценить результаты РП в геле.
Контрольные вопросы:
1. Понятие иммунитет, его виды.
2. Антигены, их характеристика.
3. Антигены микробной клетки.
4. Антитела, классы иммуноглобулинов, их характеристика.
5. Понятие серологической реакции и ее практическое использование.
6. Реакция агглютинации и методы ее постановки.
7. Реакция преципитации, ее виды и практическое применение.
8. Получение агглютинирующих и преципитирующих сывороток и их применение.
9. Получение диагностикумов и их применение.
Задания, выполняемые в ходе занятия (УИРС):
1. Поставить, учесть и оценить результаты развернутой РА с сывороткой обследуемого с подозрением на брюшной тиф и брюшно-тифозным диагностикумом.
2. Поставить, учесть и оценить результаты РА на стекле с исследуемой культурой и агглютинирующей адсорбированной сывороткой Shigella sonnei.
3. Учесть и оценить результаты РНГА с сыворотками обследуемых с подозрением на бактерионосительство возбудителя брюшного тифа и Vi-эритроцитарным диагностикумом.
4. Поставить, учесть и оценить результаты реакции термокольцепреципитации Асколи с преципитирующей сибиреязвенной сывороткой и термоэкстрактом из кожи овец, поступающей на обрабатывающее предприятие из районов неблагополучных по сибирской язве.
5. Учесть и оценить результаты РП в геле с антитоксической противодифтерийной сывороткой и исследуемыми дифтерийными культурами.
6. Биопрепараты: диагностикумы; агглютинирующие и преципитирующие диагностические сыворотки.
Методические указания к выполнению практического занятия:
Поставьте, учтите и оцените результаты реакции агглютинации (РА) на стекле.
Постановка: на обезжиренное стекло нанесите каплю диагностической сыворотки и каплю физ. раствора для контроля. В каждую каплю внесите петлей суточную культуру микроорганизмов и тщательно перемешайте, чтобы капли были равномерно мутными.
Учет: реакция учитывается в течение 5 мин. невооруженным глазом или с помощью лупы.
Контроль антигена - КА — равномерное помутнение (исключается спонтанная агглютинация).
Опыт - РА - положительная: появление хлопьев, хорошо видимых при покачивании предметного стекла.
Опыт — РА - отрицательная: жидкость остается равномерно мутной.
Оценка результатов: отсутствие спонтанной агглютинации в КА в случае положительной реакции светельствует о соответствии антигенов исследуемой культуры антителам агглютинирующей сыворотки и принадлежности культуры к соответствующему роду, виду, серогруппе или серовару.
Поставьте, учтите и оцените результаты развернутой реакции агглютинации (РА).
Постановка: ее проводят по схеме, представленной в таблице 1.
Таблица 1
Схема постановки РА.
| Ингредиенты | Разведения сыворотки | КА | КС | ||||||||||||||
| 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | |||||||||||||
   
 Изотонический раствор, мл | 1 1 | -- | |||||||||||||||
    Сыворотка обследуемого 1:50, мл | -- | -- | -- | -- | -- | 1 (1:50) | |||||||||||
| -- |
Примечание: стрелкой обозначен перенос разведенной сыворотки из пробирки
|
Учет: инкубация PA осуществляется при 37° С в течении 2 ч, затем при комнатной t° 18-20 ч.
Реакцию учитывают невооруженным глазом до встряхивания пробирок, а затем при их легком встряхивании пальцем правой руки. В сомнительных случаях используют агглютиноскоп или лупу. Опытные пробирки сравниваются с контролями:
КА - равномерное помутнение, исключается спонтанная агглютинация антигена. КС — содержимое прозрачное, отсутствие спонтанной агглютинации антител. При таких контролях результаты РА, положительные или отрицательные, будут достоверными.
Интенсивность реакции выражается плюсами:
++++ - реакция резко положительная; весь агглютинат на дне пробирки в виде зонтика, жидкость над ним прозрачная;
+++ - реакция положительная; осадок выражен, надосадочная жидкость слегка мутная;
++ - частичная агглютинация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная;
+ - сомнительная агглютинация, жидкость мутная.
При отрицательной реакции — агглютинации нет, взвесь остается равномерно мутной и по виду неотличима от содержимого пробирки с контролем антигена. Титром РА считают максимальное разведение сыворотки с интенсивностью реакции не менее, чем ++.
Оценка результатов: для подтверждения или опровержения диагноза заболевания, полученный титр РА сопоставляют с диагностическим титром. Например: диагностический титр РА при брюшном тифе равен 1:100 у непривитых детей, 1:200 у непривитых взрослых.
Учтите и оцените результаты непрямой гемагглютинации (РНГА или РПГА).
Постановка: эритроциты, предварительно нагруженные (сенсибилизированные) антигеном или антителами – эритроцитарные диагностикумы вносят в лунки плексиглазовой панели, в которых приготовлены разведения сыворотки обследуемого или экстракты антигена.
Учет: результаты учитывают после часовой инкубации до 37° С. При отрицательном результате РНГА – эритроциты оседают в виде плотного диска; при положительном – оседают в виде зонтика с интенсивностью не меньше ++.
Достоверность результатов подтверждается контролями ингредиентов:
КЭ – контроль несенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации;
КА – контроль сенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации;
КС – контроль сыворотки обследуемого с добавлением несенсибизированных эритроцитов на отсутствие в ней неспецифических факторов агглютинации.
Оценка результатов: сопоставляют титр РНГА с диагностическим титром. Например, в РНГА с сальмонеллезным Vi-диагностикумом он равен 1:40.
Таблица 2.
Схема постановки РНГА.
| Ингредиенты | Разведения сыворотки | КЭ | КД | |||||||||||
| 1:10 | 1:20 | 1:40 | 1:80 | |||||||||||
  
Физ. раствор (1-я пипетка) | 1 1 | |||||||||||||
 Сыворотка обследуемого 1:5 (1-я пипетка) | -- | -- | -- | - | - | |||||||||
| 3% взвесь эритроцитов (2-я пипетка) | - | - | - | - | - | |||||||||
| - |
в дез. раствор