Реакция непрямой гемагглютинации

При работе с растворимыми мелкодис­персными антигенами применяют реак­цию непрямой, или пассивной, гемаг­глютинации (РИГА, РПГА). Антиген сна­чала адсорбируют на инертных монодис­персных частицах или клетках, например на эритроцитах готовят эритроци-тарный диагностикум. Такие на­груженные антигеном эритроциты скле­иваются под действием иммунной сыво­ротки, содержащей антитела к данному антигену (рис. 10.2.2).

Рис. 10.2.1. Реакция агглютинации. а — хорошо выражена; б — плохо выражена.

Реакция отличается высокой чувстви­тельностью и позволяет выявлять срав­нительно небольшие концентрации ан­тител в исследуемой сыворотке. Реакцию ставят на пластмассовой пластине, в лун­ках которой готовят последовательные

разведения сыворотки больного. В каждую лунку вносят оди­наковый объем (0,5 мл) 3 % суспензии нагруженных антигена­ми эритроцитов — соответствующего эрИтроцитарного диа-гностикума. Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают резуль­тат по характеру осадка эритроцитов.

Рис. 10.2.2. Реакция непрямой гемагглютинации. Эр — эритроциты; АГ — антиген; AT — антитело.

7. Реакция преципитации в геле.Иммунодиффузия в агаро­
вом геле растворов антигенов и антител, залитых в разные
лунки, навстречу друг другу в случаях соответствия их специ­
фичности приводит к образованию специфического преципи­
тата в виде полосок и дуг в местах встречи реагентов.

Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические — испытуемые сыворот­ки. В одну из периферических лунок вносят стандартную им­мунную сыворотку соответствующей специфичности, а в дру­гую — нормальную сыворотку для контроля. Антиген с сыво­ротками инкубируют во влажной камере при 37 °С в течение 24 ч, после чего учитывают количество и ширину полос пре­ципитации между центральной лункой с раствором антигена илунками с исследуемыми сыворотками.

8. Реакция лизиса. Реакция связывания комплемента.Для постановки реакции лизиса и РСК используют комплемент, который содержится в сыворотке крови морских свинок. Ге­молитическая активность комплемента термолабильна и пол­ностью утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин при 56 "С. При адсорбции комплемента на комплексе антиген—антитело егодействие проявляется реакцией лизиса антигена, если антиген корпускулярный, или не сопровожда­ется видимыми изменениями, если это мелкодисперсные или растворимые антигены. Для учета результатов РСК вводят вспо­могательную {индикаторную) гемолитическую систему. Она со­стоит из взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика, полу­ченной путем его иммунизации упомянутыми эритроцитами. Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вслед­ствие адсорбции комплемента системой антиген—антитело (рис. 10.2.3). Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент связывается с ин­дикаторной системой антиген—антитело, т.е. эритроциты ба­рана — гемолитическая сыворотка кролика. РСК обладает вы­сокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний.

Для постановки РСК требуется точное определение коли­чественных соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой сыворотки, антигена, комплемента, ге­молитической сыворотки кролика и эритроцитов барана. По­этому постановке основного опыта предшествует титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения, титрование других ингредиентов.

Постановка РСК должна сопровождаться контролями для проверки отсутствия антикомплементарных ингредиентов в препаратах антигенов и в исследуемой сыворотке. Антиком­плементарные свойства антигенов или сыворотки могут быть связаны с присутствием в их составе денатурированных или агрегированных иммуноглобулинов, гепарина, оксидантов, мик­робных контаминант. Эти компоненты могут либо связывать комплемент, либо связывать и удалять ионы кальция или магния, необходимые для комплементопосредованного гемо­лиза.

Рис. 10.2.3. Реакция связывания комплемента. АГ — антиген; AT — антитело; Эр — эритроциты; Гем.сыв. — гемолитическая

сыворотка.

Титрование комплемента. Для определения титра и рабочей дозы производят титрование комплемента с помощью реакции иммунного гемолиза (табл. 10.2.1).

Таблица 10.2.1. Титрование комплемента (форма протокола)

Манипуляции Номера пробирок

12 3 4 5 6 7 8 9

Внесение ком- 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 - -племента в раз­ведении 1:5 мл

Внесение изото- 0,3 0,4 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,2 — нического раст­вора хлорида натрия, мл

Удаление из 0,4 0,4 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - -

пробирки из­бытка, мл

Получаемые 1:10 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35 1:40 - -

разведения ком­племента

Добавление ге- 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

молитической

смеси, мл

Инкубация 390 мин при температуре 37 "С Учет результатов

Свежую сыворотку морской свинки разводят изотоничес­ким раствором хлорида натрия от 1:10 до 1:40. К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической смеси (смеси равных объемов 3 % суспензии эритроцитов в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сы­воротки в разведении, соответствующем ее тройному титру). Пробирки выдерживают при 37 "С и через 30 мин определяют титр комплемента — наибольшее разведение комплемента, ко­торое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии ге­молитической сыворотки. Рабочую дозу комплемента рассчи­тывают, исходя из его титра. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25 %. Например, при титре комплемента 1:20 в качестве рабочей дозы берут его предыдущее разведение 1:10 (см. табл. 10.2.1).

Антигены изготавливают из взвесей убитых микроорганиз­мов, их лизатов, полных антигенов, гаптенов, тканевых экстра­ктов.

Взвесь эритроцитов барана получают из дефибринирован-ной крови барана, отмывая эритроциты изотоническим раство­ром хлорида натрия до получения полной бесцветности и про­зрачности надосадочной жидкости и готовят из них 3 % взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия.

Гемолитическая сыворотка готовится путем 3—4-кратной внутривенной иммунизации кролика 50 % взвесью бараньих эритроцитов и инактивируется при 56 "С (разрушен компле­мент). На этикетке ампул с сывороткой обозначен ее титр — максимальное разведение данной сыворотки, которое обеспе­чивает полный лизис 3 % взвеси эритроцитов барана в присут­ствии комплемента при 37 "С в течение часа. Для РСК берут гемолитическую сыворотку в тройном титре (рис. 10.2.4; на вклейке).

Постановка основного опыта Р С К. После установ­ления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК (табл. 10.2.2).

Таблица 10.2.2. Основной опыт реакции связывания комплемента
(форма протокола)_____________________________________

Манипуляции Номера пробирок

1 2 3 4 5 6 7

Внесение испытуемой сыво- 0,2 — — 0,2 — — —

ротки в разведении 1:5, мл

Внесение заведомо "поло- — 0,2 — — — — —

жительной" сыворотки, мл

Внесение заведомо "отри- — — 0,2 — — — —

цательной" сыворотки, мл

Внесение антигена, мл 0,2 0,2 0,2 — 0,2 — —

Продолжение

Манипуляции	Номера пробирок

Внесение изотонического — — — 0,2 0,2 0,4 0,4 раствора хлорида натрия, мл

Внесение комплемента в ра- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 бочей дозе, мл

Инкубация при 0—4 "С в течение 18—20 ч или при 37 "С в течение 30 мин Добавление гемолитической 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 смеси, мл

Инкубация при 37 "С в течение 20—30 мин Учет результатов

Испытуемую и контрольные сыворотки предварительно ин-активируют нагреванием при 56 °С в течение 30 мин. Стан­дартная схема постановки РСК предусматривает проведение первой фазы инкубации смеси антигена, испытуемой сыворот­ки и комплемента при 37 "С в течение 30 мин. При постановке РСК на холоде эту фазу проводят при 0—4 "С в течение 18—20 ч, что повышает чувствительность реакции.

После добавления в каждую пробирку по 0,4 мл гемолитичес­кой смеси пробирки встряхивают и выдерживают 20—30 мин при 37 °С. Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл. 10.2.2). Реак­цию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной — при полном лизисе эритроцитов, ког­да жидкость интенсивно окрашена ("лаковая кровь"). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +) _ см. рис. 10.2.4.

В качестве контроля (2-я и 3-я пробирки) учитывают реак­цию с заведомо положительной и заведомо отрицательной сы­воротками, 4-я и 5-я пробирки служат для проверки антиком­плементарных свойств сыворотки и антигена, в 6-й и 7-й пробирках контролируются рабочая доза комплемента и каче­ство гемолитической смеси (см. табл. 10.2.2).

9. Реакция Кумбса. Сложность выявления неполных (моно­валентных) антител связана с тем, что эти антитела, связываясь с эпитопами специфического антигена, не образуют структуру решетки и реакция между антигенами и антителами не выяв­ляется ни агглютинацией, ни преципитацией, ни другими тес­тами. Для выявления образовавшихся комплексов антиген—

Рис. 10.2.5. Реакция Кумбса (схема). Объяснение в тексте.

его минимальным количеством, которое дает инициальную флоккуляцию с 1 международной единицей (ME) сыворотки. Установив силу токсина, приступают к титрованию антиток­сической сыворотки. Известной силы токсин и испытуемую антитоксическую сыворотку разливают в пробирки в опреде­ленном объеме, как показано в табл. 10.2.3. Пробирки выдер­живают в водяной бане при температуре 45 °С в течение 30 мин до выпадения хлопьев в одной из них.

Таблица 10.2.3. Реакция флоккуляции (форма протокола)

Манипуляции	Номера пробирок

Внесение раствора токсина, 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

содержащего 20 Lf в 1 мл,

мл

Внесение исследуемой сы- 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 — 0,6

воротки, мл

Инкубация при 45 °С в течение 30 мин Учет результатов по иници­альной флоккуляции

антитело приходится использовать дополнительные тест-систе­мы. Для выявления неполных антител, например к резус-анти­гену эритроцитов в сыворотке крови беременной женщины, реакция ставится в два этапа: 1) к двукратным разведениям испытуемой сыворотки добавляют эритроциты, содержащие ре­зус-антиген, и выдерживают при 37 °С в течение часа; 2) к тща­тельно отмытым после первого этапа эритроцитам добавляют кроличью античеловеческую антиглобулиновую сыворотку (в заранее оттитрованном рабочем разведении). После инкубации в течение 30 мин при температуре 37 °С результаты оценивают по наличию гемагглютинации (положительная реакция). Необ­ходимо ставить контроль ингредиентов реакции: 1) антиглобу-линовая сыворотка + заведомо сенсибилизированные специ­фическими антителами эритроциты); 2) обработанные нор­мальной сывороткой эритроциты + антиглобулиновая сыво­ротка; 3) обработанные исследуемой сывороткой резус-отрица­тельные эритроциты + антиглобулиновая сыворотка (рис. 10.2.5).

10. Реакция флоккуляции. В результате взаимодействия ток­сина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и ранняя (иници­альная) флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.

Реакцию ставят в два этапа. Сначала по стандартной сыво­ротке устанавливают пороговую величину флоккуляции Lf (Limes flocculationis) в 1 мл токсина. Lf токсина определяется

Инициальная флоккуляция проявляется в той пробирке, где количество токсина соответствует количеству международных единиц сыворотки. Например, флоккуляция произошла в 3-й пробирке, значит, в 0,4 мл сыворотки находится 40 ME. Сле­довательно, 1 мл сыворотки содержит 40:0,4=100 ME.

11. Антистрептолизиновая реакция.Реакция основана на фе­номене нейтрализации гемолитического действия микроб­ного токсина (О-стрептолизина) антитоксическими антитела­ми иммунной сыворотки.

Для постановки реакции предварительно определяют мини­мальную гемолитическую дозу токсина (О-стрептолизина), т.е. наименьшее его количество, которое вызывает гемолиз 0,2 мл 5 % взвеси эритроцитов кролика. Затем определяют рабочую дозу О-стрептолизина, т.е. наибольшее количество токсина, которое в смеси с У₂ АЕ (антитоксической единицы) стандарт­ной антитоксической сыворотки полностью нейтрализуется и не вызывает гемолиза эритроцитов. Для постановки основного опыта готовят разведения исследуемой сыворотки, к каждому из которых добавляют рабочую дозу токсина, инкубируют 45 мин при 37 °С, затем вносят равный объем взвеси эритроцитов и инкубируют 1 ч при 37 'Си 18 ч при комнатной температуре. Обязательным является контроль на возможность спонтанного гемолиза эритроцитов. В качестве положительной учитывается реакция, где отсутствует гемолиз. С учетом максимального

разведения сыворотки, при котором наблюдается полная за­держка гемолиза, рассчитывают содержание АЕ в 1 мл испы­туемой сыворотки (см. табл. 12.1.3).

12. Реакция торможения гемагглютинации.РТГА основана на том, что при взаимодействии вирусных антигенов (гемагглю-тининов) со специфическими антителами иммунной сыворот­ки происходит блокирование (нейтрализация) гемагглютини-рующей способности вируса, т.е. торможение гемагглютина­ции.

Развернутая РТГА проводится в лунках пластмассовых плас­тин. Предварительно определяют титр вирусного антигена в реакции гемагглютинации с целью выбора рабочей дозы. Ра­бочее разведение берут в 16 раз меньше титра. В лунках готовят 2-кратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,25 мл, добавляют по 0,25 мл взвеси вируса в рабочем разведении и инкубируют 2 ч при температуре 37 °С. Затем добавляют по 0,5 мл 1 % взвеси куриных эритроцитов, инкубируют еще 2 ч и оценивают результат по феномену гемагглютинации. При положительной РТГА образуется плотный осадок эритро­цитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА.

Разные методы количественного определения антигенов и антител существенно различаются по чувствительности, т.е. по тому минимальному количеству антигенов или антител, кото­рое может быть выявлено с помощью данного метода (табл. 10.2.4).

Таблица 10.2.4. Сравнительная чувствительность разных методов ко­личественного определения антител и антигенов

Тесты	Выявляемое количество, мкг/мл
	антител	антигенов

20,0 1,0 20,0 0,5 0,05 0,5 0,01 0,01 0,01 0,001 0,01 0,0005 0,000005 0,0005 0,000005 0,000005

Преципитация

Иммуноэлектрофорез

Связывание комплемента

Радиальная иммунодиффузия

Агглютинация бактерий

Гемолиз

Непрямая (пассивная) гемагглю-

тинация

Ингибиция гемагглютинации

Нейтрализация токсина

Радиоиммунный анализ

Иммуноферментный анализ

Нейтрализация вирусов

Тема 10.3. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Иммунный статус человека складывается из комплекса не­специфических и специфических механизмов, обеспечиваю­щих антибактериальную, противовирусную и противоопухоле­вую защиту организма. К механизмам неспецифической защи­ты против бактерий относятся фагоцитоз гранулоцитами и моноцитами/макрофагами и активация системы комплемента по альтернативному пути. Макрофаги не только захватывают и убивают бактерии, но при контакте с ними продуцируют и секретируют биологически активные молекулы — цитокины, запускающие неспецифический защитный процесс воспале­ния. Механизмы неспецифической противовирусной и проти­воопухолевой защиты: клетки — естественные киллеры и мо­лекулы семейства интерферонов. Специфическую антибакте­риальную защиту против внеклеточно паразитирующих бакте­рий обеспечивают специфические антитела — иммуноглобули­ны путем усиления фагоцитоза (опсонизация) или активации системы комплемента по классическому пути иммунными комплексами. Специфическая защита от бактериальных токси­нов является функцией специфических антитоксических анти­тел — иммуноглобулинов, способных нейтрализовать экзоток­сины бактерий. Специфическую защиту против внутриклеточ-но паразитирующих микроорганизмов берут на себя активиро­ванные Т-лимфоциты и макрофаги, продуцирующие цитоки­ны: интерлейкины, гамма-интерферон, фактор некроза опухо­ли, обеспечивая при этом развитие в очаге инфекции реакции иммунного воспаления — гиперчувствительности замедленно­го типа (ГЗТ). Специфическую противовирусную защиту обес­печивают активированные цитотоксические лимфоциты (CTL), способные распознать инфицированную клетку и убить ее при непосредственном контакте. В специфической противовирус­ной защите велика роль специфических антител иммуноглобу­линов, которые могут нейтрализовать внеклеточные вирусы или вызвать гибель инфицированных вирусом клеток посред­ством антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦТ) естественных киллеров и других клеток.

Оценка иммунного статуса включает количественную и ка­чественную оценку основных факторов неспецифической за­щиты (фагоцитирующих клеток, системы комплемента, есте­ственных киллеров, системы интерферонов) и основных зве­ньев иммунной системы: Т-лимфоцитов и их главных конеч­на* ^пР⁰ДУктов - цитокинов; В-лимфоцитов и их главных ко­нечных продуктов — иммуноглобулинов.

на ^_т°™^{чествен}"ая оценка клеточных популяций начинается ц_и"™ клинического анализа крови, который дает информа-ч «и о количестве циркулирующих в крови гранулоцитов мо-

ноцитов и лимфоцитов. Дальнейшая дифференцировка лим­фоцитов основывается на наличии у них так называемых по­верхностных маркеров, т.е. особых молекул (их принято обо­значать "CD" — сокращение от английского термина "clusters of differentiation') в составе клеточных мембран, которые в качестве антигенов выявляются при взаимодействии со специ­фическими моноклональными антителами.

Качественная (функциональная) оценка клеточных популя­ций и субпопуляций проводится с помощью соответствующих функциональных тестов: у Т- и В-лимфоцитов оценивают про-лиферативный ответ на контакт со стандартными митогенами или микробными антигенами (реакция бласттрансформации лимфоцитов — РБТЛ) или ответ продукцией цитокинов на кон­такт с митогеном. У фагоцитирующих клеток оценивают функ­цию фагоцитоза: активность захвата стандартных частиц — объ­ектов фагоцитоза, бактерицидность фагоцитов косвенно оце­нивается по высоте окислительного взрыва, индуцированного фагоцитозом (НСТ-тест). Концентрацию молекул иммуногло­булинов четырех основных изотипов — классов (IgG, IgM, IgA, IgE) в сыворотке крови и в других биологических жидкостях (слюна, спинномозговая жидкость и др.) определяют, пользу­ясь наборами специфических моноклональных антител, полу­ченных против изотипспецифических антигенов этих иммуно­глобулинов. С помощью наборов таких антител можно прово­дить реакцию комплексообразования (иммуноглобулины, при­сутствующие всыворотке крови, выполняют в этой реакции функцию антигенов), результаты которой поддаются количест­венному учету с помощью нефелометра или спектрофотометра. Другой вариант учета — проведение твердофазного иммуно-ферментного анализа с участием тех же изотипспецифических моноклональных антител и антииммуноглобулиновой мечен­ной пероксидазой сыворотки против иммуноглобулинов мыши (так как все моноклональные антитела получены из клеток мышей).

▲ План

▲ Программа

1. Изучение методов оценки факторов неспецифической защиты организма.

2. Изучение методов оценки Т-системы иммунитета.

3. Изучение методов оценки В-системы иммунитета.

Демонстрация

1.Характерная морфология гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в мазке крови, окрашенном по методу Романовского—Гимзы.

2. Отдельные стадии фагоцитоза бактерий и дрожжепо-добных грибов рода Candida макрофагами и грануло-цитами.

Задание студентам

1. Произвести микроскопический учет фагоцитоза час­тиц латекса лейкоцитами крови. Рассчитать показате­ли активности фагоцитирующих клеток.

2. Протоколировать и оценить результаты определения гемолитической активности комплемента сыворотки крови.

3. По готовым результатам выявления поверхностных маркеров на мембранах мононуклеарных лейкоцитов крови рассчитать показатели относительного и абсо­лютного количества естественных киллеров, В-лим­фоцитов, Т-лимфоцитов, их субпопуляций в крови и сопоставить с интервалами колебаний этих показате­лей у здоровых лиц.

4. По готовым результатам иммуноферментного опреде­ления содержания в сыворотке крови иммуноглобули­нов разных изотипов {IgG, IgM, IgA, IgE) сделать за­ключение, сопоставив эти результаты с интервалами колебаний этих показателей у здоровых лиц.

5. Обосновать выбор специальных тестов для характе­ристики функций иммунокомпетентных клеток.

Методические указания

1. Методы оценки фагоцитирующих клеток крови.Образец крови или лейковзвеси инкубируют с бактериями или другими объектами фагоцитоза (частицы латекса, полистиреновые час­тицы) в течение 1—2 ч, после чего из этой смеси приготавли­вают мазок, окрашивают по методу Романовского—Гимзы и микроскопируют, подсчитывая 100 клеток для определения процента фагоцитирующих клеток и количества бактерий (час­тиц), захваченных этими клетками (рис. 10.3.1; на вклейке). В норме процент фагоцитирующих лейкоцитов колеблется от 40 до 80 %, а количество захваченных частиц на 1 клетку — от 1 до 5.

В качестве косвенного показателя бактерицидное™ фагоци­тирующих клеток оценивают интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах по способности восстанавливать желтый краситель нитросиний тетразолий (НСТ) с формированием в цитоплазме клеток осадка темно-синего формазана. Чем ак­тивнее окислительный взрыв в фагоцитах, тем большая доля клеток содержит осадок формазана. После подсчета клеток доля формазан-положительных выражается в процентах. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц только с красителем без индуктора окислительного взрыва доля формазан-положитель­ных клеток не превышает 1—2 %. При инкубации лейкоцитов здоровых лиц в присутствии индуктора окислительного взрыва (объекты фагоцитоза, бактериальный липополисахарид или полисахарид) все 100 % фагоцитов могут ответить окислитель-

ным взрывом и накоплением осадка формазана. Снижение доли формазан-положительных клеток свидетельствует о де­фектности кислородзависимого механизма бактерицидное™ фагоцитов.

2. Методы определения количества лимфоцитов в крови.Изу­чение лимфоцитов начинается с их выделения из крови. Мо-нонуклеарные лейкоциты (лимфоциты, моноциты) отделяют от других клеток крови (гранулоцитов и эритроцитов) с помощью центрифугирования в градиенте плотности специальной смеси препаратов: фикол, верографин. Взятая из вены кровь смеши­вается с антикоагулянтом, вносится в пробирку с названной смесью и центрифугируется. Имеющие большую плотность эритроциты и гранулоциты образуют осадок на дне пробирки, амононуклеарные клетки образуют кольцо на поверхности градиентной смеси, откуда могут быть перенесены в отдельную пробирку и отмыты от градиентной смеси.

Все зрелые лимфоциты имеют одинаковую морфологию: малых лимфоцитов с плотным ядром и узким ободком цито­плазмы. Дифференцировка популяций и субпопуляций лимфо­цитов связана с выявлением поверхностных маркеров — осо­бых для каждого типа клеток антигенов с помощью соответст­вующих специфических антител.

Естественные киллеры несут поверхностный маркер CD16. Все Т-лимфоциты (тотально) несут поверхностный маркер CD3. Т-лимфоциты делятся на субпопуляции: Т-хелперы несут маркер CD4, а цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) несут маркер CD8. Все В-лимфоциты несут поверхностный маркер CD 19. В-лимфоциты несут на поверхностной мембране поверх­ностные иммуноглобулины, которые могут быть выявлены в качестве антигенов с помощью флюоресцирующих антиимму-ноглобулиновых антител (в том числе — против отдельных изо-типов иммуноглобулинов). Эти поверхностные иммуноглобу­лины также рассматриваются как поверхностные маркеры В-лимфоцитов.

Определение количества лимфоцитов разных популяций и субпопуляций по поверхностным маркерам проводится с по­мощью двух разных вариантов методов:

—люминесцентной или световой микроскопии мазков цельной крови или взвеси мононуклеаров, обработанных соответствующими моноклональными антителами, ме­ченными флюорохромом или ферментом;

—автоматического подсчета клеток с использованием про­точного цитофлюориметра (рис. 10.3.2).

При использовании первого методического варианта важно получить видимый осадок комплексов антител с красителем на поверхности клетки. Этот метод очень трудоемкий и длитель-

Клетки выше порога флюоресценции

Клетки ниже порога флюоресценции

Рис. 10.3.2. Подсчет лимфоцитов разных популяций и субпопуляций с помощью проточного цитофлюориметра.

ный. Подсчет количества основных субпопуляций лимфоцитов данным методом занимает неделю.

В отличие от этого с помощью автоматизированного под­счета с использованием современного прибора — проточного цитофлюориметра — это удается сделать за один день. Образец цельной крови инкубируют с моноклональными антителами, меченными флюоресцентным красителем, пропускают через тонкую трубочку, на выходе из которой формируется струя из капель. Многие из них содержат только по одной клетке. Каждая капля проходит перед лазерным лучом. Если капля содержит клетку, клетка вызывает отклонение лазерного луча, а лазерный луч возбуждает свечение флюорохрома в молекуле антитела, связанного с антигеном на поверхности клетки (с поверхностным маркером). Чувствительный фотоумножитель

улавливает оба сигнала: светорассеяние дает информацию о размерах и гранулярности клетки, а флюоресценция дает ин­формацию о количестве связанных клеткой меченых антител, т.е. об экспрессии поверхностных маркеров. В случае исполь­зования двух разных моноклональных антител, конъюгирован-ных с разными флюорохромами (флюоресцеин, дающий зеле­ное свечение, и фикоэритрин, дающий красное свечение), отдельные клетки оцениваются по интенсивности двух типов флюоресценции.

В результате исследования большого количества клеток (10 тыс. за 30 с) после компьютерной обработки прибор дает количественные данные о проценте клеток в данной популя­ции, несущих соответствующие поверхностные маркеры: CD3, CD4, CD8, CD16, CD19 и др.. (табл. 10.3.1).

Таблица 10.3.1. Количественное содержание лимфоцитов в циркули­рующей крови здоровых людей

Популяции	Поверх-	% от всего	Абсолютное количе­ство клеток х Кг
и субпопуляции	ностные	количества
лимфоцитов	маркеры	лимфоцитов	в 1 л крови
Лимфоциты (всего)			1,50-3,50
В-лимфоциты	CD19	15 (10-25)	0,30-0,90
Т-лимфоциты (всего)	CD3	75 (60-90)	1,00-2,50
Т-лимфоциты/хелперы	CD4	50 (32-65)	0,50-1,60
Т-лимфоциты/киллеры	CD8	25 (16-39)	0,30-0,90
Естественные киллеры	CD16	10 (5-15)	0,20-0,30

3. Методы оценки функций лимфоцитов.Функциональную полноценность Т-лимфоцитов косвенно оценивают с помо­щью кожных проб, отражающих интенсивность реакций ГЗТ в отношении наиболее распространенных микробных антиге­нов: трихофитина, кандидозного аллергена, стрептококковых антигенов, туберкулина, дифтерийного анатоксина. Антиген вводят внутрикожно и через 48 ч измеряют диаметр инфильт­рата — уплотнения, отражающий интенсивность реакции ГЗТ.

Покоящиеся лимфоциты циркулируют в крови в G0 фазе клеточного цикла. Важнейшей функцией лимфоцитов является пролиферация в ответ на распознавание конкретного антигена. Однако для изучения и оценки этой функции удобнее исполь­зовать в качестве стандартных индукторов пролиферации не­специфические поликлональные митогены. Для Т-лимфоцитов такими поликлональными митогенами являются препараты растительного происхождения (полученные из бобовых расте­ний), для В-лимфоцитов — компоненты бактерий: липополи-сахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий и А-протеин стафилококка. После активации поликлональным

Рис. 10.3.3. Тест для оценки пролиферативной активности лимфоци­тов: реакция бласттрансформации лимфоцитов.

митогеном лимфоцит быстро входит в G1 фазу и проходит весь клеточный цикл. Для количественной оценки этого процесса в популяции клеток обычно исследуют включение ³Н-тимиди-на в ДНК клеток как показатель их пролиферации. Этот тест пролиферативной активности лимфоцитов часто фигурирует под названием: реакция бласттрансформации лимфоцитов (рис. 10.3.3).

Другой подход к оценке функций Т-лимфоцитов заключа­ется в измерении их способности продуцировать цитокины. При распознавании антигена и при ответе на поликлональные митогены Т-лимфоциты активируются и продуцируют неспе­цифические белки-медиаторы — цитокины. Определение ти­пов цитокинов и их количества в культуральной среде Т-лим­фоцитов позволяет оценить функциональную активность кле­ток (рис. 10.3.4). Количество цитокинов определяют, судя поих биологической активности, или выявляют цитокины как антигены с помощью специфических МКАТ и ИФА.

Функции В-лимфоцитов косвенно оценивают по уровням иммуноглобулинов и изогемагглютининов в сыворотке крови. С 2-летнего возраста в сыворотке крови людей с группой крови II(А) должны быть анти-В-антитела, в сыворотке крови людей с группой крови Ш(В) должны быть анти-А-антитела, а у людей с группой крови 1(0) должны присутствовать анти-А- и анти-В-изогемагглютинины.

4. Методы определения содержания в сыворотке крови имму­ноглобулинов разных изотипов.Содержание в сыворотке крови иммуноглобулинов четырех основных изотипов (IgG, IgM, IgA, IgE) определяют, пользуясь наборами специфических антисы-

диффундирует радиально из лунок с его разведениями, взаи­модействуя со специфическими антителами в геле. При этом образуются кольца преципитации, диаметр которых пропорци­онален концентрации антигена. Далее по калибровочному гра­фику зависимости диаметра кольца от концентрации стандарт­ного антигена определяют концентрацию иммуноглобулинов отдельных изотипов IgG, IgM, IgA в испытуемых образцах сы­вороток, предварительно измерив диаметры колец преципита­ции (табл. 10.3.2). Количественное содержание разных изоти­пов иммуноглобулинов в сыворотке крови проводят также с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с учас­тием изотип-специфических МКАТ и антииммуноглобулино-вой меченной пероксидазой сыворотки против иммуноглобу­линов мыши (так как все МКАТ получены из клеток мышей).

Таблица 10.3.2. Количественное содержание иммуноглобулинов раз­ных изотипов в сыворотке крови здоровых людей

Рис. 10.3.4. Определение количества цитокина (фактора роста клеток) по его биологической (ростстимулирующей) активности.

вороток или МКАТ, полученных против изотип-специфичес-ких антигенов этих иммуноглобулинов.

Для количественного определения содержания иммуноглобу­линов разных изотипов в биологических жидкостях используют радиальную иммунодиффузию, твердофазный иммунофермент-ный анализ или РИА (при определении количества IgE).

Радиальная иммунодиффузия по Манчин и. На плос­кой поверхности создают равномерный слой геля, содержащий специфическую антиглобулиновую антисыворотку против одного из изотипов иммуноглобулинов. Из лунок, проштампо­ванных в геле и заполненных испытуемыми сыворотками, мо­лекулы иммуноглобулинов диффундируют в гель и образуют кольца преципитации с соответствующими антииммуноглобу-линовыми антителами. Диаметр колец преципитации увеличи­вается до тех пор, пока не истощится в данном образце сыво­ротки иммуноглобулин, который служит антигеном.

Радиальная иммунодиффузия пригодна для количественно­го определения любых классов сывороточных иммуноглобули­нов. Образцы исследуемых сывороток помещают в лунки ага­ровых гелей, которые содержат антитела против IgG, IgM или IgA в известной концентрации. Одновременно в ряд лунок вносят стандартный антиген (иммуноглобулин определенного класса) в разных концентрациях. Диффундирующие в агар иммуноглобулины образуют с антиглобулиновыми антителами кольца преципитации, диаметр которых отражает содержание в сыворотке иммуноглобулинов соответствующего класса. Стандартный антиген (иммуноглобулин определенного класса)

Изотип иммуноглобулина	Обозна­чение	% от всех иммуно­глобули­нов сыво­ротки	Количество иммуногло­булинов, г/л
	средние величины	интервалы колебаний

Иммуноглобулин G IgG 70-75 12,0 7,50-15,50

Иммуноглобулин М IgM 8—10 1,2 0,65—1,65

Иммуноглобулин A IgA 15—20 2,0 1,25—2,50

Иммуноглобулин Е IgE 0,005 0,0005 0-0,0005

Титрование комплемента сыворотки крови. Метод основан на феномене комплементзависимого лизиса нагружен­ных антителами эритроцитов барана. В соответствии с между­народным стандартом за единицу активности комплемента принимается такое его количество, которое вызывает гемолиз 50 % сенсибилизированных эритроцитов в стандартных усло­виях и обозначается СН50.

В пробирку с сывороткой крови в разведении 1:10 добавля­ют гемолитическую систему (смесь эритроцитов барана с ге­молитической сывороткой кролика). После 45-минутной ин­кубации при 37 °С сохранившиеся эритроциты осаждают цент­рифугированием. Интенсивность гемолиза регистрируется фо­тометрически. Затем рассчитывают количество СН50 на 1 мл цельной сыворотки. У здоровых людей титр комплемента мо­жет колебаться в интервале 40—80 СН50 на 1 мл.

Титрование комплемента по 50 % гемолизу не позволяет судить о состоянии отдельных компонентов системы компле­мента. В настоящее время отдельные компоненты системы комплемента определяют иммунохимически при помощи стан­дартных моноспецифических антисывороток.

Тема 10.4. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА. ВАКЦИНЫ. ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ И ИММУНОГЛОБУЛИНЫ

Иммунный ответ на инфекцию или иммунизацию вакцин­ными препаратами позволяет оценить функциональную актив­ность иммунной системы в целом. Выявление в организме продуктов иммунного ответа свидетельствует о том, что чело­век был инфицирован соответствующим возбудителем, что имеет большое эпидемиологическое значение. Нередко выяв­ление той или иной формы специфического иммунного ответа на конкретный антиген позволяет уточнить диагностику забо­левания.

Оценка гуморального иммунного ответа базируется на вы­явлении специфических антител в сыворотке крови и других биологических жидкостях. Как правило, речь идет об опреде­лении количества антител (титра). Наиболее информативным считается определение количества антител в динамике инфек­ционного заболевания, так как именно нарастание титра анти­тел свидетельствует о текущей инфекции. Нарастание титра антител можно использовать и для оценки эффективности проведенной вакцинации. Диагностическую значимость имеет определение принадлежности специфических антител к тому или иному изотипу иммуноглобулинов: для первичной инфек­ции наиболее характерно накопление антител изотипа IgM, a рецидив инфекции сопровождается преобладанием антител изотипа IgG.

Клеточно-опосредованный иммунный ответ оценивается чаще всего с помощью кожных проб. При внутрикожном вве­дении небольшой дозы экстракта из микроорганизма, содер­жащего его антигены, в положительном случае наблюдается покраснение, припухание и уплотнение (инфильтрат) на месте введения через 24—48 ч. Положительная реакция свидетельст­вует об инфицировании человека соответствующим микроор­ганизмом, которое привело к формированию в организме кло­на Т-лимфоцитов, способных распознать его антигены и акти­вироваться. Положительная кожная проба может быть резуль­татом эффективной вакцинации против соответствующей ин­фекции.

План

А Программа

1. Возможности методов серодиагностики при оценке гуморального иммунного ответа.

2. Методы выявления иммунных комплексов.

3. Кожно-аллергические пробы для оценки клеточного

иммунитета и реакции гиперчувствительности замед­ленного типа.

4. Методы выявления специфической сенсибилизации Т-лимфоцитов.

5. Получение и применение вакцин, анатоксинов.

6. Получение и применение иммунных сывороток и им­муноглобулинов.

Демонстрация

1.Результаты теста торможения миграции лейкоцитов крови в присутствии причинного антигена.

2. Набор ампулированных препаратов инфекционных аллергенов, вакцин, сывороток, иммуноглобулинов, диагностикумов.

Задание студентам

1. Протоколировать и оценить результаты развернутых ре­акций агглютинации, поставленных с парными сыво­ротками крови человека, иммунизированного бактери­альной вакциной. Оценить эффективность вакцинации.

2. Протоколировать и оценить результаты РСК, постав­ленных с парными сыворотками крови человека, им­мунизированного вирусной вакциной. Оценить эф­фективность вакцинации.

3. Протоколировать и оценить результаты РСК, постав­ленной с сывороткой крови больного с бактериальной инфекцией для дифференциации первичной инфек­ции и рецидива.

лМетодические указания

1. Реакция торможения миграции лейкоцитов. Воснове дан­
ного метода лежит способность лимфоцитов после повтор­
ного контакта с антигеном, к которому они были ранее
сенсибилизированы, продуцировать различные лимфоки-
н ы, в том числе влияющие на миграцию индикаторных кле­
ток (гранулоциты, моноциты, макрофаги). Реакция торможе­
ния миграции лейкоцитов (РТМЛ) периферической крови в
присутствии причинного антигена позволяет выявить специ­
фическую сенсибилизацию Т-лимфоцитов. РТМЛ ставят в ка­
пиллярах или под слоем агарозы. Проводят инкубацию лейко­
цитов крови в присутствии и в отсутствие причинного мик­
робного антигена, после чего измеряют зоны миграции (в про­
центах) в присутствии антигена по сравнению с контролем,
принятым за 100 %.

В случае выявления сенсибилизации к антигену на­блюдается торможение миграции лейкоцитов (индекс ниже

2. Постановка и оценка кожно-аллергической пробы.Для вы­
явления специфической сенсибилизации (при туберкулезе,

бруцеллезе и других инфекционных заболеваниях) ставят кожно-аллергические пробы. Например, при постановке про­бы Манту внутрикожно вводят раствор туберкулина опреде­ленной концентрации. Реакцию учитывают через 24—48 ч, оценивая степень выраженности гиперемии и инфильтрат вокруг места введения (рис. 10.4.1; на вклейке). В основе положительной кожной пробы лежит клеточная реакция гиперчувствительности замедленного типа, которая отражает специфическую сенсибилизацию организма к данно­му инфекционному аллергену. Она возникает в результате те­кущего, перенесенного заболевания, вакцинации или инфици­рования организма.

3. Выявление нарастания титра антител в серологических ре­акциях с парными сыворотками больного или вакцинированного.Показателем развития гуморального иммунного ответа являет­ся нарастание титра специфических антител в сыво­ротке крови в течение 3—4 нед после инфицирования или вакцинирования. Это устанавливается в реакции с парными сыворотками, т.е. сыворотками, полученными от одного и того же человека в динамике инфекционного или вакцинального про­цесса (например, на 1-й и 3—4-й неделе). Появление антител в сыворотке человека, у которого ранее этих антител не было, называется сероконверсией. Диагностическое значение прида­ется, как правило, 4-кратному и более увеличению титра анти­тел.

При бактериальных инфекциях или вакцинации бактери­альными вакцинами с парными сыворотками ставят реакции агглютинации, РИГА или РСК (табл. 10.4.1).

Таблица 10.4.1. Результаты развернутой реакции агглютинации с бак­териальным диагностикумом ипарными сыворотками человека, вакци­нированного бактериальной вакциной

Сроки взятия	Разведения сыворотки	Конт­роль сы­воротки	Конт­роль диа­гноста-кума
	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800
До вакцинации Через 3 нед после вакцинации	+++ — — — — +++ +++++— —	—

Таблица 10.4.2. Результаты РСК с диагностикумом вируса гриппа (эпидемический штамм) и парными сыворотками человека, обследован­ного в период эпидемии гриппа

Сроки взятия крови

Конт­роль сы­воротки

Конт­роль диа-гности-кума

Разведения сыворотки

1:10 1:20 1:40 1:80 1:160

В самом начале + + — — — — —

эпидемии

Через месяц после + + + + — — —

начала эпидемии

4. Постановка РСКс целью дифференцирования IgM и IgG.

Серологические реакции могут быть использованы для ориен­тировочного определения принадлежности специфических ан­тител к одному из двух основных изотипов иммуноглобулинов IgM или IgG. Возможность дифференцировать эти два изотипа иммуноглобулинов основана на их различной чувствительнос­ти к действию 2-меркаптоэтанола, цистеина и других редуци­рующих веществ, которые вызывают разрывы дисульфитных связей в молекулах IgM и их распад на субъединицы, лишенные антительной активности. Под действием той же концентрации 2-меркаптоэтанола молекулы IgG сохраняют свою целостность и антительную активность. Исходя из этого ставят серологи­ческую реакцию (РСК или РТГА) с испытуемой сывороткой: нативной и обработанной 2-меркаптоэтанолом (табл. 10.4.3).

Таблица 10.4.3. Результаты РСК с сывороткой больного, обработан­ной 2-меркаптоэтанолом (2МЕ), для определения принадлежности анти­тел к IgG или IgM изотипу иммуноглобулинов

Исследуе-			Разведения сыворотки
ротка	1:100	1:200	1:300	1:400	1:500	1:600	1:700	1:800	1:1000
После об­работки 2МЕ Без обра­ботки 2МЕ	+ +	+ +	+ + + + + +	+	+

При вирусных инфекциях или вакцинации вирусными вак­цинами с парными сыворотками ставят РСК, PTIA и реакцию нейтрализации вирусов (табл. 10.4.2).

Нарастание титра антитоксических антител контролируют с помощью реакции флоккуляции или нейтрализации токсина.

При первичной инфекции гуморальный ответ начинается с синтеза IgM, а при рецидиве инфекции на повторную встречу с тем же антигеном иммунная система отвечает преимущест­венным синтезом IgG.

Снижение титра специфических антител в исследуемой сы-

воротке в результате обработки 2-меркаптоэтанолом свидетель­ствует в пользу первичной инфекции.

Для определения принадлежности специфических антител к определенному классу (изотипу) иммуноглобулинов исполь­зуют также твердофазный иммуноферментный метод. Специ­фический антиген фиксируется на поверхности лунок планше­тов из полистирола и инкубируется с исследуемой сывороткой. После отмывания от несвязанных иммобилизованным антиге­ном белков сыворотки связанные антитела-иммуноглобулины идентифицируются с помощью антиизотипической антиглобу-линовой сыворотки или соответствующих МКАТ. Их связыва­ние в свою очередь устанавливается с помощью антииммуно-глобулиновой сыворотки с ковалентно прикрепленным фер­ментом.

Глава 11

Часть II

ЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ