Микробиологическое исследование. Цель исследования: выделение и идентификация ЭПКП.

Цель исследования: выделение и идентификация ЭПКП.

Материал для исследования

1. Испражнения.

2. Рвотные массы.

При необходимости исследует отделяемое из носа и зева, гной из уха, кровь, мочу, кусочки органов трупа.

При возникновении очага заболеваний коли-энтеритом исследуют (по эпидемиологическим показаниям) пищевые продукты, смывы с рук обслуживающего персонала, игрушек и других предметов.

Способы сбора материала

Способы сбора материала

Примечание. Чем раньше от начала заболевания исследуют испражнения, тем вероятнее возможность выделения возбудителя.

Основной метод исследования

Бактериологический

Ход исследования

Первый день исследования

Первый день исследования

Второй день исследования

Вынимают из термостата засеянные накануне чашки и просматривают их в падающем или проходящем свете. При наличии малиново-красных колоний на среде Эндо (с металлическим блеском или без него) или фиолетовых на среде ЭМС ставят пробную реакцию агглютинации на стекле для дифференциации ЭПКП от других разновидностей эшерихий.

Для постановки пробной реакции агглютинации отбирают не менее 10 изолированных колоний, отмечая или нумеруя их на обратной стороне чашки; часть каждой намеченной колонии снимают петлей и агглютинируют в капле поливалентной сыворотки или иммуноглобулина. Испытывают только часть колонии, чтобы в случае положительной реакции агглютинации можно было из оставшейся части колонии выделить чистую культуру.

Типовые или поливалентные эшерихиозные сыворотки (или иммуноглобулины) изготовляют в производственных условиях. Поливалентные эшерихиозные ОК-сыворотки (или ОК-иммуноглобулины) содержат антитела к нескольким О- и К-антигенам эшерихий. С их помощью ориентировочно определяют принадлежность выделенной культуры к ЭПКП. Например, поливалентная сыворотка О26, О55, О111 позволяет выявить одноименные культуры эшерихий. Сыворотки разводят согласно указанию на этикетке.

В лаборатории можно приготовить смесь отдельных ОК-сывороток, соединяя не более 5 сывороток, чтобы разведение каждой было не выше 1:10.

Постановка пробной реакции агглютинации. На одно или два хорошо обезжиренных предметных стекла наносят 10 капель поливалентной сыворотки (или иммуноглобулина). В каждую каплю вносят часть намеченной колонии и растирают ее. Колонии, давшие реакцию агглютинации, отсевают в пробирки со скошенным агаром и ставят в термостат на 18-20 ч. Если ни одна из 10 колоний не дала реакции агглютинации, дают отрицательный ответ.

Третий день исследования

Вынимают из термостата посевы и просматривают их. На МПА энтеропатогенные кишечные палочки образуют обычно влажный, блестящий, сероватый налет, реже он бывает мутным. Выросшую на скошенном агаре культуру проверяют повторно в реакции агглютинации на стекле с поливалентными эшерихиозными сыворотками (или иммуноглобулинами). Если выделенная культура дает реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой (иммуноглобулином), то ее агглютинируют с каждой типовой сывороткой (иммуноглобулином) раздельно в разведении 1:5 - 1:10. Агглютинация с живой культурой имеет ориентировочное значение.

Далее необходимо подтвердить принадлежность выделенной культуры к роду Эшерихия биологическими тестами. Для этого производят посев культуры на полужидкие среды Гисса с лактозой, глюкозой, маннитом, сахарозой, мальтозой и другими сахарами, а также на бульон или пептонную воду для определения образования индола и сероводорода. Для этого в пробирки под пробку опускают две индикаторные бумажки, смоченные реактивами, выявляющими образование этих веществ. Одна бумажка при наличии индола краснеет, другая при наличии сероводорода чернеет.

При ферментации Сахаров реакция среды становится кислой и цвет индикатора изменяется. Если, помимо кислоты, образуется газ, в среде появляются пузырьки. Одновременно определяют подвижность бактерий: делают посев в полужидкий (0,2%) агар уколом. Подвижные бактерии дают помутнение всей среды, неподвижные - растут только по уколу.

Для окончательной идентификации выделенной культуры ставят развернутую реакцию агглютинации с живой и гретой культурами: с живой - для определения К-антигена, с гретой - для определения О-антигена. Для постановки развернутой реакции агглютинации антиген готовят следующим образом: 3-5 мл изотонического раствора натрия хлорида смывают культуру со скошенного агара. Полученную суспензию разливают в две пробирки. Одну из них прогревают на водяной бане при 100° С в течение часа.

Развернутую реакцию агглютинации ставят в двух рядах пробирок. Сыворотку в обоих рядах разводят в соотношении 1:50 - 1:100 (в 1-й пробирке) до титра, указанного на этикетке ампулы с сывороткой. В первый ряд добавляют по 2 капли живой культуры, во второй - по 2 капли гретой культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 18-24 ч.

Четвертый день исследования

Производят учет изменений сред Гисса, регистрируют образование индола и сероводорода.

Большинство представителей эшерихий ферментирует углеводы с образованием кислоты и газа, расщепляет белковый питательный субстрат до образования индола.

Учет пробирочной реакции агглютинации проводят при помощи лупы или агглютиноскопа. Агглютинация с живой культурой крупнохлопчатая, с убитой - мелкозернистая. Реакцию считают положительной, если агглютинация с гретой культурой отмечается в разведении сыворотки не ниже половины титра сыворотки, а живая культура агглютинируется сывороткой, разведенной не менее чем 1:200. Играет роль и соотношение антител к гретой и живой культуре. Разведение сыворотки, в котором отмечается агглютинация с гретой культурой, должно превышать разведение сыворотки, в котором агглютинируется живая культура, не менее чем в 2 раза. В табл. 31 приведены различные варианты результата реакции агглютинации.

Таблица 31. Результаты реакции агглютинации с культурами эшерихий

Примечание. Возможны три варианта реакции: 1) гретая культура агглютинируется сывороткой в больших разведениях, чем живая, реакция - положительная; 2) живая и гретая культура дают агглютинацию в одинаковых разведениях сыворотки. Такой результат может свидетельствовать об отсутствии в культуре К-антигена; агглютинация живой и гретой культур вызвана О-антигеном. В этих случаях необходима повторная постановка реакции агглютинации; 3) агглютинация живой культуры при отсутствии агглютинации гретой позволяет дать отрицательный ответ. Очевидно, в культуре нет О-антигена, соответствующего O-антителам в сыворотке (рис. 41).

Рис. 41. Схема выделения и идентификации энтеропатогенных кишечных палочек

Контрольные вопросы

1. Какой материал исследуют для выделения эшерихий?

2. С помощью каких сывороток можно дифференцировать ЭПКП?

3. Для чего ставят развернутую реакцию агглютинации с живой и гретой культурами эшерихий?

Задание

1. Получите у преподавателя чашки Петри с засеянной на среде Эндо культурой и произведите пересев на пробирку со скошенным агаром.

2. Возьмите у преподавателя культуру ЭПКП на скошенном агаре, смойте изотоническим раствором натрия хлорида. Часть смыва прогрейте на водяной бане при 100° С. Разведите сыворотку в двух рядах пробирок и поставьте реакцию агглютинации описанным выше способом.

Питательные среды

Дифференциальные среды Эндо и ЭМС служат для выращивания кишечных бактерий. Выпускаются в виде сухого порошка. Согласно указаниям на этикетке отвешивают определенное количество сухой среды, растворяют в соответствующем количестве воды, кипятят, помешивая, и разливают в стерильные чашки Петри.