Методы определения чувствительности к антимикробным препаратам

1. Метод серийных разведений:

Методом серийных разведений МИК (минимальная ингибирующая концентрации) антибиотика определяют по минимальной концентрации антибиотика, задерживающей видимый рост микроорганизма в пробирках или на чашках с питательной средой.

Например, для определения МИК тетрациклина в отношении культуры Staphylococcus aureus, выделенной от больного, готовят двух кратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном бульоне. Контролями культуры и антибиотика являются, соответственно, бульон без антибиотика и бульон с первым разведением антибиотика. В опытные и контрольные пробирки вносят стандартизованную суспензию молодой агаровой культуры S. aureus и после суточной инкубации учитывают результат.

МЕТОД СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ АНТИБИОТИКА:

№ п\п	Ингредиенты	Концентрация антибиотика (мкг/мл):
						КК	КА
	Питательный бульон, мл. Основной раствор антибиотика (128 мкг/мл), мл вносится только в первую пробирку и контроль антибиотика (КА).	2,0 } 2,0	2,0 } 2,0	2,0 } 2,0	2,0 } 2,0	2,0 } 2,0	2,0 } 2,0Þ	2,0	2,0   2,0
	Исследуемая культура (106 -107 бактерий в 1мл), мл.	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1

Термостат +37⁰C, 18 – 20 часов.

Примечание:

КК – контроль культуры

КА – контроль антибиотика

Þиз последней пробирки 2,0 мл выливают в дезинфицирующий раствор.

Учетным признаком является наличие или отсутствие мутности бульона (роста культуры) в пробирках. В контроле культуры должна быть мутность, в контроле антибиотика – нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации тетрациклина, при которой отсутствует видимый рост возбудителя (бульон в пробирке прозрачный). Допустим, бульон будет мутным в опытных пробирках с концентрациями, 2, 4 и 8 мкг/мл, а в пробирках с концентрациями 16, 32 и 64 мкг/мл прозрачным. В этом случае МИК тетрациклина = 16 мкг/мл. Исходя из значений МИК, и зная концентрацию антибиотика (К) в сыворотке крови (очаге инфекции) после его введения, можно определить терапевтический индекс: Т=МИК/К. Терапевтический индекс не должен превышать значения 0,3. Известно, что величина “К” тетрациклина при введении средне-терапевтических дозы антибиотика равняется – 4 мкг/мл (при использовании максимальных доз – 10 мкг/мл). Следовательно, в данном случае терапевтический индекс будет равен Т = 16:4 = 4 (> 0,3), т.е. возбудитель устойчив к антибиотику и лечение тетрациклином не даст антимикробного эффекта в отношении S. aureus у данного больного.

Серийные разведения в плотных средах чаще используют для одновременного тестирования большого количества штаммов (для посева можно использовать специальный штамп-репликатор). Учетным признаком в этом случае является наличие или отсутствие роста на поверхности агара. Метод серийных разведений считается наиболее точным, но относительно трудоемким и дорогим.

2. Диско-диффузионный метод:

При определении чувствительности методом диффузии в агар, чистую культуру возбудителя засевают “газоном“ на агар Mueller-Hinton в чашке, например, тампоном, смоченном в стандартизованной (10⁸ КОЕ/мл) суспензии микроорганизма. Затем на поверхность агара укладывают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, которые диффундируют в агар, создавая градиент концентрации. На чашку диаметром 90 мм равномерно укладывают 6-8 дисков. После инкубирования в термостате измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности к тому или иному антибиотику: чувствительный, умеренно-устойчивый, устойчивый.

К категории чувствительных относят те штаммы, для подавления роста и размножения которых в организме больного, достаточным будет использование средних терапевтических доз антибиотика. В категорию умеренно-устойчивых относят микроорганизмы, для подавления роста которых, in vivo потребуются максимальные терапевтические дозы препарата. Категорию устойчивых составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным in vivo.

3. Метод Е-тестов:

Метод определения чувствительности с помощью Е-тестов. Е-тесты представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16, 8, 4…….. мкг/мл). Е-тесты, как и диски при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде “газона“. После инкубирования вокруг полоски формируется эллипсовидная зона задержки роста микроорганизма, которая сужается в области малых концентраций и “пересекает“ полоску на уровне, соответствующем величине МИК.