Метод по определению антигеносвязывающих лимфоцитов.

Принцип: Этот диагностический подход основан на том, что не позже чем через 3 суток после контакта с антигеном в крови практически у всех людей обнаруживаются лимфоциты, специфически связывающие такой антиген. Такое определение проводят при исследовании выделенных из крови лимфоцитов и использовании комплекта иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии. Комплект иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии выпускает НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ РК (480002, г.Алматы, ул. М.Макатаева,34).

Состав комплектов и необходимое оснащение: Комплект состоит из 1 флакона (6,6 мл) диагностикума (Д) и 1 флакона (6,6 мл) контрольного диагностикума (Дк). Д представляет собой взвесь фиксированных эритроцитов кур, сенсибилизированных дифтерийным анатоксином (Ед), и фиксированных эритроцитов быка, сенсибилизированных столбнячным анатоксином (Ес), Дк представляет собой взвесь фиксированных эритроцитов кур и быка в тех же концентрациях, в которых они входят в Д, но не сенсибилизированных анатоксинами. Дк применяют для определения уровня спонтанного розеткообразования.

При проведении анализа, кроме комплекта иммунореагентов, используют следующие реактивы, препараты и оборудование:

· гепарин, Московский эндокринный завод;

· фикол-400 (Швеция) или (ФРГ), верографин, (Чехия), вместо верографина для приготовления градиента можно применить урографин, уротраст, триамбраст (Чехия) и тразограф (Испания).

Фикол-верографиновый градиент готовят смешением 12 частей 9% р-ра фикола-400, приготовленного на дистиллированной воде, и 5 частей 33,9% р-ра верографина (или заменяющего его препарата), приготовленного на дистиллированной воде. Правильность приготовления градиента контролируют преометром.

· 0,85% раствор натрия хлористого;

· 3% раствор уксусной кислоты;

· 3% раствор глутарового альдегида;

· 0,1% раствор метиленового синего;

· смесь Никифорова;

· 96^о этиловый спирт;

· эриометр, диапозон измеряемых им плотностей должен включать 1,077-1,079 г/см³;

· дозаторы пипеточные на 0,22 и 0,1 мл;

· камера Горяева;

· микроскоп бинокулярный;

· центрифуга с горизонтальным ротором;

· термостат на 37^оС;

· холодильник на 4^оС;

· счетчик клеток (для регистрации лимфоцитов), например, счетчик лабораторный СЛ-1, ТУ-64-1-3031-78, Москва;

· пробирки, пипетки градуированные и пастеровские, предметные и покровные стекла, резиновая груша.

Фикол-400 может быть приобретен через фирмы, представляющие в Республике Казахстан препараты и химреактивы, верографин и заменяющие его препараты – через аптечную сеть.

Получение крови и выделение лимфоцитов, реакцию смешанного розеткообразования, учет результатов проводят в соответствии с Инструкцией по применению комплекта иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии, прилагаемой к комплекту иммунореагентов для экстренной специфической диагностики дифтерии.

Диагностическую оценку результатов анализа проводят на основании статистического определения достоверной разности содержания выявленных розеткообразующихся лимфоцитов в мазках с опытным (д) и контрольным (Дк) диагностикумами. Антигенсвязыавющие лимфоциты данной специфичности выявлены, если такая разность статистики достоверна.

Антигенсвязывающие лимфоциты данной специфичности обнаруживаются в результате недавнего контакта с соответствующим антигеном. Таким антигеном может явиться не только токсин дифтерийных бактерий или столбнячных бацилл, но и дифтерийный или столбнячный анатоксин (компоненты вакцин). Поэтому при обнаружении антигенсвязывающих лимфоцитов дифтерийной специфичности необходимо дифференцировать возможность заболевания и поствакцинальную иммунную реакцию. Критерии такой дифференциации:

· вакцинальный анамнез: если обследуемый был вакцинирован за 2-3 недели до обследования, выявление антигенсвязывающих лимфоцитов дифтерийной специфичности может расцениваться как результат вакцинальной иммунной реакции;

· поскольку дифтерийная моновакцина практически не используется, при вакцинальной реакции на АКДС, АДС и АДС-М одновременно выявляются антигенсвязывающие лимфоциты и столбнячной специфичности. Одновременное обнаружение АСД дифтерийной и столбнячной специфичности даже при отсутствии анамнестических данных с недавней вакцинации расценивается, как результат недавней вакцинации.

Антигенсвязывающие лимфоциты специфчности могут быть выявлены не только у больного дифтерией, но и у носителя токсигенных дифтерийных бактерий. Поэтому при положительном результате обнаружения АСД-дифтерийной специфичности необходимо диффренцировать дифтерию и носительство токсигенных дифтерийных бактерий у обследуемого с другим заболеванием (чаще всего - ангины).

Критерии такой дифференциации:

· клинические, их надежность ограничена;

· серологические, если у обследуемого пациента в начале заболевания выявлен защитный уровень дифтерийного анатоксина, вероятность клинически выраженной формы дифтерийной инфекции тем меньше, чем выше активность дифтерийного анатоксина.

Антигенсвязывающие лимфоциты дифтерийной специфичности обнаруживаются в течение всего периода заболевания. Поэтому метод может быть использован не только для ранней диагностики дифтерии. Введение специфической лечебной сыворотки не мешает последующему обнаружению АСЛ.

Метод определения антигенсвязывающих лимфоцитов может быть при необходимости использован для обследования контактных в очагах дифтерии с целью возможно более раннего выявления больных и носителей токсигенных дифтерийных бактерий.

ПРИЛОЖЕНИЕ № 6

к приказу МЗ РК № 113

от 11.03.97г.