Лептоспиры в темном поле
В поле зрения на темном фоне лептоспиры имеют вид блестящих нитей длиной 6-10 мкм, совершающих быстрые поступательные и вращательные движения. Оба конца лептоспир изогнуты в виде крючков, поэтому возбудитель имеет S, C форму, на конце крючков видны пуговчатые утолщения.
2. Знакомство со схемой лабораторного диагноза лептоспирозов по таблице(зарисовать)
В составе рода Leptospira выделяют 2 вида:
а) патогенные лептоспиры объединены в один вид Leptospira interrogans, которые, исходя из различий в антигенах, разделены на 200 сероваров. Среди них патогенны для человека: L.icterrohaemo-rrhagiae, L.canicola, L.grippotyphosa, L.pomona, L.haebdomadis и др. Основной фактор патогенности лептоспир – эндотоксин, вызывающий общую интоксикацию и кровоизлияния за счет повышения проницаемости сосудов.
б) сапрофитные лептоспиры – Leptospira biflexa – свободноживущие (морская вода, влажные почвы, заливные луга и др.).
Лептоспиры вызывают острые лихорадочные заболевания, которые в зависимости от возбудителя, тяжести течения и выраженности отдельных симптомов делят на 3 главные формы:
- иктерогеморрагический лептоспироз, который вызывает L.icterrohaemorrhagiae, он протекает с выраженной желтухой;
- лептоспироз каниколя, возбудитель которого L.canicola, он характеризуется кровоизлияниями;
- доброкачественные безжелтушные лептоспирозы,объединенные под общим названием «водная лихорадка», возбудителями которой являются десятки сероваров лептоспир, в том числе L.pomona, L. grippotyphosa и др.
Для микробиологической диагностики лептоспирозов используют методы:
- бактериоскопический
- бактериологический
- серологический
- биологический
Бактериоскопический метод. Бактериоскопический метод основан на обнаружении лептоспир в исследуемом материале. Его применяют в период повышения температуры с 1 по 5–7 день болезни. В качестве исследуемого материала используют кровь, спинномозговую жидкость. Кровь забирают асептично в объеме 5 мл и смешивают с цитратом натрия, отстаивают 1 час. На исследование берут верхний слой жидкости.
Спинномозговую жидкость берут специальной иглой в стерильную пробирку.
С 10–16 дня болезни на микроскопическое исследование берут мочу стерильным катетером в стерильную посуду.
Для приготовления мазка из отстоявшейся крови берут верхний слой жидкости, мочу и ликвор предварительно центрифугируют, мазок готовят из осадка. Лептоспиры с трудом воспринимают окраску, поэтому микроскопируют нативный материал с живыми возбудителями в темном поле, из каждой пробы материала готовят не менее 10–15 препаратов. Микроскопический метод имеет ориентировочное значение и требует подтверждения другими методами диагностики.
Бактериологический метод. Бактериологический метод основан на выделении чистой культуры лептоспир из исследуемого материала, который засевают на среду Уленгута (водно-сывороточная среда) или специальную среду для лептоспир у постели больного. Посевы помещают в термостат при 28 °С, через каждые 5–6 дней контролируют рост, наблюдают в течение 3 месяцев.
Размножение лептоспир происходит медленно, плотность концентрации их в растворе невысокая, поэтому среда в пробирках остается прозрачной в течение всего времени наблюдения. Контроль роста производят при помощи микроскопии раздавленной капли в темном поле.
При обнаружении лептоспир проводят их идентификацию в реакции агглютинации с типовыми лептоспирозными сыворотками.
Серологический метод. Серологический метод основан на выявлении антител в сыворотке больных, которые обнаруживаются с 6–8 дня болезни. Для обнаружения антител используют реакцию агглютинации-лизиса. Для постановки реакции исследуемую сыворотку прогревают, готовят 5–6 двукратных разведений от 1:50 до 1:800–1:1600, которые разливают в несколько рядов панели или пробирок, к каждому разведению добавляют в качестве антигена живые типовые культуры лептоспир. После перемешивания оставляют в термостате на 1 час, результат учитывают в темном поле.
При учете реакции отмечают феномен лизиса и агглютинации. Реакция агглютинации лептоспир, не сопровождающаяся лизисом, не может считаться специфичной. Диагностическим титром считают 1:100, максимальный титр наблюдают на 14–17-й день. Антитела сохраняются в крови длительное время, поэтому серологическое исследование рекомендуется проводить в динамике. Нарастание титра антител при повторном исследовании, безусловно, свидетельствует о заболевании.
Для постановки серологического диагноза можно использовать РСК. Комплементсвязывающие антитела появляются в крови больных с 5–6 дня болезни и сохраняются 8–10 месяцев после выздоровления. В качестве антигена используется поливалентный антиген, приготовленный из 20 сероваров, высушенных лептоспир, наиболее часто встречающихся. Методика выполнения реакции не отличается от общепринятой. Положительной считается реакция в разведении 1:10 при интенсивности 4 и 3 плюса.
Биологический метод. Биологический метод основан на выделении лептоспир путем заражения животных. Для этого используют кроликов-сосунков 7–8-дневного возраста, которых заражают внутрибрюшинно или подкожно. ПЕРСОНАЛ ДОЛЖЕН РАБОТАТЬ В РЕЗИНОВЫХ ПЕРЧАТКАХ. За животными наблюдают 15 дней, делая высевы из крови. Если в материале были лептоспиры, то через 3–5 суток животные заболевают и погибают, тогда делают посевы из органов. Если нет кроликов, то используют молодых морских свинок, белых мышей. Целесообразно для заражения животных пользоваться разным материалом в зависимости от периода болезни: до 5-6 дня болезни вводят животным кровь, с 8 дня – спинномозговую жидкость, с 13 дня – утреннюю порцию мочи.
3. Оценить диагностическую значимость серологического метода в диагностике лептоспироза по таблице 25(сделать заключение, оформить протокол)
Таблица 25
| Сроки взятия сыворотки крови, дни | Разведение сыворотки, титр | Контроль | |||
| 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:3200 | ||
| 8-й день заболевания | - | - | - | - | - |
| 15-й день заболевания | + | + | + | - | - |
Вывод:
4. Знакомство с препаратами для специфической диагностики, профилактики и лечения лептоспироза(записать в тетрадь)
Лептоспирозная вакцина.Лептоспирозная вакцина представляет собой взвесь убитых нагреванием лептоспир. Используется для создания иммунитета против наиболее распространенных видов лептоспир. Для приготовления вакцины культуру каждого вида лептоспир выращивают в жидкой питательной среде до определенной концентрации, затем убивают нагреванием при 56 °С, смешивают с убитыми культурами других видов и консервируют 0,3% р-ром фенола. Вакцину применяют для создания активного иммунитета у людей, подвергающихся опасности заражения. Против лептоспироза вакцинируют людей в очагах инфекции, подвергающихся опасности заражения от животных: ветеринаров, зоотехников, свинарок, телятниц, пастухов, птичниц, рабочих собачьих питомников и звероводческих ферм, работников мясокомбинатов, лиц, занятых уборкой сена на заливных лугах, отловом рыбы в пресных водоемах, охотников.
Вакцину вводят подкожно со строгим соблюдением правил асептики в виде двух инъекций с интервалом в семь дней. Детей в возрасте от 7 до 16 лет вакцинируют только по эпидемическим показаниям, особое внимание уделяют тому контингенту детей, которые проживают в сельской местности, на территории которой расположены водоемы, загрязняемые животными (водопои, стоки ферм). На введение вакцины вырабатывается активный поствакцинальный иммунитет, относительно кратковременный, поэтому по показаниям через год проводят ревакцинацию путем однократного введения вакцины. Ревакцинация при лептоспирозе является не лучшим способом профилактики. Основные усилия должны быть направлены на ликвидацию источников инфекции, главным образом, среди сельскохозяйственных животных. Эти мероприятия должны разрабатываться и осуществляться совместно медицинской и ветеринарной службой.
Гамма-глобулин противолептоспирозный. Противолептоспирозный гамма-глобулин представляет собой поливалентный препарат, содержащий иммунологически наиболее активную фракцию сыворотки, получаемую из крови гипериммунизированных волов путем осаждения и последующего растворения гамма-глобулиновой фракции белков спиртовым методом при низкой температуре. Содержание антител в 2–3 раза превышает таковое в исходной иммунной сыворотке. Активность препарата оценивают в реакции агглютинации, титр должен быть не менее 1:8000 в отношении всех лептоспир, из которых приготовлена вакцина. Препарат предназначен для лечения лептоспироза, при ее введении формируется пассивный иммунитет. Предварительно необходимо определить индивидуальную чувствительность больного к воловьему белку. Раннее применение гамма-глобулина приводит к ослаблению явлений интоксикации, снижению температуры, исчезновению менингеальных симптомов.