И факультативно анаэробных микроорганизмов

в 1 г (мл) продукта - (Общее микробное число ОМЧ) - "МАФАнМ"

Метод основан на способности мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на питательных средах определенного состава при температуре 30°С с образованием колоний, видимых при увеличении в 2 раза.

Для определения количества мезофильных бактерий следует выбирать разведения, при посеве которых на чашках вырастает на менее 30 и не более 300 колоний.

Из каждой пробы делают посев глубинным методом на 2 параллельные чашки Петри из 2 - 3 последовательных разведений в количестве 1,0 мл, используя для этого 2%-й агар, приготовленный из сухого питательного агара (см.стр.44). Контролировать температуру надежнее и проще, если агар разливают небольшими порциями в пробирки (12 - 15 мл). Агар в пробирках быстрее расплавляется и охлаждается более равномерно до нужной температуры. Чашки заливают расплавленным и остуженным до 45°С агаром сразу же после внесения материала. В противном случае может наблюдаться неравномерное распределение колоний в виде отдельных скоплений в толще агара; для более равномерного распределения посевного материала, кроме того, содержимое чашки перемешивают вращательными движениями.

После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат дном вверх, инкубируют по рекомендации ФАО/ВОЗ при 30°С в течении 72 часов; при необходимости предварительный учет производят через 48 часов. Количество колоний подсчитывается на каждой из засеянных чашек. Счет колоний на чашках производят с помощью прибора для счета колоний бактерий или лупы. Для лучшей видимости считают колонии на темном фоне (под чашку кладут темную бумагу), чашки помещают дном кверху. Каждую колонию отмечают на дне чашки чернилами или тушью.

При подсчете придерживаются следующих правил:

а) если на чашке выросло небольшое количество колоний, примерно 100, подсчитывают все колонии;

б) если колонии распределены равномерно и их количество измеряется несколькими сотнями (200 - 300 колоний), допускается подсчет колоний не менее чем на 1/3 площади чашки. В этих случаях дно чашки делят карандашом на 6 секторов и считают колонии в 3 секторах. Затем делают пересчет на всю площадь чашки: вычисляют среднее количество колоний на площади одного сектора и полученное количество колоний на одном секторе умножают на 6;

в) если на чашке вырастает более 300 колоний, они распределены равномерно и не представляется возможным повторить анализ, то, применяя прибор для счета колоний бактерий, подсчитывают 10 полей зрения площадью по 1 см2 в разных местах чашки. Полученные числа складывают и выводят среднее арифметическое. Чтобы высчитать количество колоний на всей чашке, полученное среднее число умножают на площадь чашки (ПиR2). Обычно диаметр чашки равен 8,5 - 10 см, Пи = 3,14. Подставив данные в формулу, получаем при диаметре чашки, равном 10 см, площадь чашки 78,5 см2. При отсутствии прибора для счета колоний бактерий можно использовать обычную миллиметровую бумагу, в которой вырезают "окошко" площадью 1 см2. Подсчет колоний производят с лупой, как указано выше.

Пример, если среднее число колоний на 1 см2 составляет 18, диаметр чашки 10 см, то число колоний на всей площади чашки 18 х 78,5 = 1413, округляя в ответе, указывают 1400.

Число колоний, выросших на чашке, должно отражать количество жизнеспособных микроорганизмов, содержащихся в засеянном объеме исследуемого материала. Поскольку последний, как правило, засевают в разведенном виде, число выросших на чашке колоний умножают на степень взятого разведения, рассчитывают среднее арифметическое и устанавливают количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в 1 г (мл) продукта.

При установлении количества мезофильных бактерий не все чашки могут быть использованы для вычисления среднего арифметического:

а) нельзя использовать посевы для вычисления среднего арифметического, если количество выросших колоний на чашках менее 30. В этом случае в протокол исследований вносят показатели обсемененности, полученные при подсчете колоний только по одной или двумя чашкам, число колоний на которых больше 30. В случае роста колоний на засеянных чашках в количестве менее 30, в результатах анализа рекомендуется следующая формулировка: "Рост единичных колоний при посеве (указать количество засеянного продукта)".

б) не используются посевы для вычисления среднего арифметического показателя на тех чашках, на поверхности которых более чем на 1/2 площади отмечается ползучий рост спорообразующих микроорганизмов, последние могут маскировать рост прочих бактерий. Возможны случаи, когда на чашках из всех разведений получен рост споровых микроорганизмов, и подсчет изолированных колоний практически не возможен. В этих случаях в протоколе исследования следует указывать: "Рост спорообразующих микроорганизмов".

Пример расчета: Если на чашках Петри при посеве 0,1 г продукта выросло в среднем 135 колоний, а при посеве 2-го разведения (0,01 г продукта) - 9 колоний, то в результатах исследования учитывают цифровые данные, полученные при посеве 1-го разведения, т.е. количество микроорганизмов 135 х 10 = 1350 в 1 г продукта.

Для получения более точных данных по количеству мезофильных бактерий, целесообразно сопоставлять результаты подсчета колоний, полученные на чашках в посевами материала из последовательных разведений. Числа подсчитанных колоний должны примерно соответствовать кратности взятых разведений. Если количество колоний на чашках с посевами из последующих разведений (1:10, 1:100) почти совпадает или мало между собой разнится, то это указывает на недостаточное перемешивание посевного материала при приготовлении разведений и перед посевом.