Серологический метод исследования
Серологический метод диагностики предусматривает применение 2 направлений исследований: серодиагностики (выявление специфических антител в сыворотке крови обследуемых) и сероидентификация (определение антигенных свойств выделенного возбудителя с целью установления его вида и типа).
При серодиагностике применяются реакции агглютинации, преципитации, лизиса, РСК, реакции с использованием меченых антигенов или антител. Компонентами этих реакций являются: сыворотки крови обследуемых больных и стандартные антигенные препараты. Целью исследований являются определение титров антител к возбудителям инфекционных заболеваний в исследуемых сыворотках.
Выявление высоких титров специфических антител особенно если они достигают уровня так называемых «диагностических» титров, подтверждает предполагаемый диагноз. Большое значение придается исследование парных сывороток, когда одновременно титруются сыворотки взятые в самом начале заболевания (3-4ый день) и сыворотки, полученные на 7-й - 10-й день заболевания. Диагностическое значение имеет 4-кратное нарастание титров антител.
При сероидентификации чаще других используется реакция агглютинации на стекле. Компоненты реакции: выращенная чистая культура возбудителя заболевания (антиген) и стандартные диагностические иммунные кроличьи сыворотки (антитела).
Достоинство серологического метода - простота, доступность, высокая чувствительность, специфичность, экспрессность.
Недостатки: необходимость дорогостоящих стандартных препаратов и аппаратуры.
Аллергологический метод
Данный метод предусматривает выявление сенсибилизации организма к тому или иному инфекционному агенту, что имеет большое диагностическое значение. Известно, что течение некоторых инфекционных заболеваний сопровождается формированием гиперчувствительности замедленного типа. В связи с этим внутрикожное введение таким больным малых доз аллергена вызывает соответствующую реакцию со стороны организма, вызванную повторной встречей с аллергеном. Реакция протекает по замедленному типу, и на месте введения аллергена через 48-72 часа появляется покраснение, припухлость, иногда - инфильтрат (положительная реакция). Если организм не сенсибилизирован, внутрикожное введение не вызовет никакой реакции со стороны организма (отрицательная реакция). Промышленностью выпускаются специальные препараты для проведения кожно-аллергических проб: туберкулин, дизентерин, бруцеллин, тулярин и др.
Аллергологический метод имеет особенно большое значение в тех случаях, когда выявление возбудителя инфекционного заболевания затруднено или же невозможно (например, при лепре) или когда для этого требуется много времени (например, при бруцеллезе). Проба с туберкулином используется на практике не только с диагностической целью, но и для определения сроков ревакцинации детей вакциной БЦЖ, а также для изучения коллективного противотуберкулезного иммунитета.
Достоинства аллергологического метода - его простота, достоверность, экспрессность.
Недостаток - ограниченность применения, так как далеко не при всех инфекционных заболеваниях формируется гиперчувствительность замедленного типа.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ
ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
В настоящее время иммунологические методы исследования широко применяются для лабораторной диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний.
Реакции взаимодействия между антигенами и антителами называются серологическими (serum – сыворотка, logos – учение).
Суть всех серологических реакций состоит в специфическом соединении антигенов и соответствующих им антител с образованием комплекса. Серологическая реакция возможна, если имеется иммунологическое соответствие (гомологичность) – главных компонентов – антигенов и антител. В основе иммунологической специфичности лежит структурная комплементарность антигена и антитела.
Процесс взаимодействия антигенов и антител протекает в две фазы – специфическую и неспецифическую. Первая фаза развивается быстро. Она состоит из специфического соединения активного центра антитела с детерминантными группами соответствующего (гомологичного) антигена. Более медленно развивается последующая фаза, неспецифическая – это внешнее проявление реакции антиген-антитело (выпадение хлопьев, помутнение среды и т. д.)
Серологические реакции применяются с двумя целями:
1) для выявления антител в исследуемой сыворотке с помощью известных антигенов (серодиагностика);
2) для установления неизвестного антигена с помощью известных сывороток (сероидентификация).
Определение неизвестного антигена при микробиологических исследованиях проводится с целью установления родовой, видовой, типовой принадлежности возбудителей, выделенных у обследуемого. В таких случаях из двух основных компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является антиген, реакция должна проводиться с заведомо известными антителами. При этом антигеном является чистая культура выделенных из исследуемого материала микроорганизмов. В качестве заведомо известных антител применяются иммунные диагностические сыворотки. Последние получают из крови животных (чаще всего кроликов), предварительно иммунизированных соответствующими бактериальными антигенами. Иммунные сыворотки должны содержать высокий уровень специфических антител.
Помимо этого, серологические реакции могут использоваться для определения различных небактериальных антигенов: для установления групп крови, тканевых антигенов, опухолей, для подбора пар донор – реципиент при трансплантации органов и тканей и т. д.
Серологические реакции могут применяться и для обнаружения антител в сыворотке крови. В таких случаях требуется заведомо известный антиген (диагностикум). В качестве антигенов могут быть использованы взвеси живых или убитых микробов, экстракты или изолированные химические фракции из них.
Многочисленные серологические реакции, применяемые в настоящее время в практике здравоохранения, различаются по феномену, выявляющему связь антигена и антитела. Видимое проявление реакции будет различным в зависимости от того, какая методика используется, в каком физическом состоянии применяется антиген или иммунная сыворотка, участвует ли в реакции комплемент. Например, если используется корпускулярный антиген, имеет место феномен агглютинации – склеивание частиц (реакция агглютинации). Поскольку корпускулярные антигены состоят из частиц относительно крупного размера, выпадает видимый хлопьевидный осадок. Если же в реакции применяется растворимый антиген, наблюдается выпадение мелко зернистого осадка – преципитата (реакция преципитации). В случае, если в реакцию взаимодействия бактериальных антигенов и иммунной сыворотки вводится и комплемент, происходит бактериолиз (растворении бактериальных антигенов) или лизис эритроцитов (когда они используются в качестве антигена). Применение в серологических реакциях иммунных сывороток, меченых флюорохромами, ферментами или радиоизотопами, позволяет установить специфическое связывание антигенов с антителами по соответствующему феномену (свечение, изменение цвета или активности радиоизотопной метки).
Для оценки серологических реакций применяются такие критерии, как специфичность и чувствительность. Специфичность – это способность антигенов реагировать только с гомологичными антителами. Чувствительность – способность к специфическому взаимодействию при минимальных количествах антигенов и антител.
Реакция агглютинации
Реакция агглютинации (РА) – специфическое взаимодействие антигенов с антителами, выражающееся в склеивании антигенов под воздействием антител сыворотки и выпадении их в осадок в присутствии электролита. Была первой из предложенных серологических реакций.
Особенность реакции агглютинации состоит в том, что в качестве антигенов при её постановке используются клетки или другие корпускулярные частицы. Реакция основана на способности корпускулярных антигенов специфически соединяться, с гомологичными антителами иммунных сывороток с образованием осадка в виде зерен, хлопьев, комочков. Реакция проходит только в присутствии электролитов. Антигены, применяемые в реакции, называются агглютиногенами, антитела – агглютининами, а образующийся осадок – агглютинатом.
В качестве антигена в реакции агглютинации можно применять взвесь живых культур в изотоническом растворе хлорида натрия или микробы, убитые формалином, спиртом или прогреванием, а также эритроциты, лейкоциты или другие клетки.
Источником антител служит известная агглютинирующая сыворотка, полученная путем иммунизации животных соответствующими антигенами, или сыворотка обследуемого больного.
Существуют разные способы постановки реакции агглютинации. Из них наиболее часто применяются: ориентировочная реакция на стекле, развернутая агглютинация в пробирках, реакции гемагглютинации и непрямой гемагглютинации (РНГА).