Работа № 1. Микробный антагонизм

Занятие № 1.3.2

ВЛИЯНИЕ НА МИКРООРГАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ.

АНТИБИОТИКИ. БАКТЕРИОФАГИ

Цель занятия:

изучить характер влияния и механизмы действия биологических факторов на микроорганизмы; химиотерапевтические вещества.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Биологические факторы, влияющие на микроорганизмы.
2. Химиотерапия. Понятие о химиотерапевтических препаратах и химиотерапевтическом индексе. Принципы антимикробной терапии.
3. Микробный антагонизм, его механизмы. Микроорганизмы-антагонисты – продуценты антибиотиков.
4. Классификация антибиотиков по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия, способам получения.
5. Методы изучения антибиотикочувствительности бактерий.
6. Осложнения антибиотикотерапии, их предупреждение.
7. Бактериофаги (умеренные и вирулентные). Принципы применения в медицине.
8. Эубиотики (пробиотики).

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• определять чувствительность бактерий к антибиотикам и бактериофагам; расшифровать антибиотикограмму и определять минимально-подавляющую концентрацию антибиотиков.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ:

· методами микробиологических исследований с использованиеммедико-технической аппаратуры;

· применением эубиотиков для лечения, бактериофагов и антибиотиков для диагностики, профилактики и лечения; информацией о причинах возникновения, циркуляции антибиотикорезистентных микроорганизмов.

Работа № 1. Микробный антагонизм

Цель работы:изучитьявлениемикробного антагонизма между кишечной палочкой (штамм E. coli М-17) и вибрионом (водный вибрион).

Самостоятельная работа:а) зарегистрировать результат опыта совместного культивирования кишечной палочки и водного вибриона. Указать возможные механизмы микробного антагонизма. Зарисовать, сделать вывод.

водный вибрион

кишечная палочка

Результат:

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод: ______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) объяснить назначение и механизм действия эубиотиков, классифицировать предложенные препараты. Результаты внести в таблицу.

Название	Действующее начало	Получение	Применение	Способ применения

Вывод: _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лактобактерин

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Линекс

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Бифиформ

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Карбенициллин

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Цефотаксим

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Мазь тетрациклиновая

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Таблетированный левомицетин

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Диски с полимиксином

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Рифампицин

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

Коли-бактериофаг

Классификационное положение_____________________________________________________

Действующее начало______________________________________________________________

Получение_______________________________________________________________________

Применение______________________________________________________________________

Способ применения_______________________________________________________________

К работе № 1

Микробный антагонизм

При посеве исследуемого материала или смеси микробов присутствие микробов-антагонистов обнаруживается по светлым зонам, окружающим их колонии. Эти зоны свидетельствуют о подавлении роста угнетаемого микроба, причем величина зоны угнетения определяет ту или иную степень активности антагониста. Механизмы микробного антагонизма: 1) разная скорость роста микроорганизмов; 2) синтез метаболитов: экзотоксинов и бактериоцинов.

Методика.

На чашку с МПА широкой полосой засевают суточную бульонную культуру E.coli М-17. Перпендикулярно посеву вплотную подсевают суточную бульонную культуру угнетаемого микроба (вибрион). Результат учитывают через сутки пребывания в термостате: рост угнетаемого микроба отступает от полосы, заселенной антагонистом.

Практическое значение антагонизма для медицины:1) использование микробов-антагонистов для производства антибиотиков; 2) применение эубиотиков (пробиотиков) - бактериальных препаратов, содержащих живые, антагонистически действующие микроорганизмы для угнетения патогенных и условно-патогенных микробов и лечения нарушений нормального микробиоценоза кишечника (дисбактериоза): колибактерин, бифидумбактерин, лактобактерин, бификол.

Механизм действия пробиотиков (эубиотиков): лечебный эффект обусловлен антагонистическим действием эубиотиков к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Иммунотропное действие проявляется стимуляцией макрофагального фагоцитоза, нормализацией соотношения Т-хелперов, Т-супрессоров, активацией Т-киллеров, индукцией интерферона. Нормализуют микробиоценоз, стимулируют местные репаративные процессы в кишечнике, обеспечивают организм витаминами групп В и К, способствуют полноценному перевариванию пищи.

Схема описания пробиотиков:

Название препарата ………………….

Классификационное положение:пробиотик

Действующее начало: метаболиты - бактериоцины

Получение: из живых представителей нормальной микрофлоры организма человека, высушенных лиофильно

Применение: для лечения дисбактериоза, нормализации кишечного

микробиоценоза

Способ применения: перорально

К работе № 2

Антибиотики

Антибиотики –химические соединения биологического происхождения, оказывающие избирательно повреждающее или губительное действие на микроорганизмы. Антибиотики, применяемые в медицинской практике, продуцируются актиномицетами (лучистыми грибами), плесневыми грибами, а также некоторыми бактериями. К этой группе относят также и синтетические аналоги и производные природных антибиотиков.

По спектру микробного действия антибиотики отличаются: одни влияют преимущественно на Гр⁺ бактерии (биосинтетические пенициллины, макролиды), другие – в основном на Гр^- бактерии (полимиксины). Ряд антибиотиков обладает широким спектром действия (полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, тетрациклины, левомицетин, рифампицин и т.д.).

Антибиотики воздействуют на микроорганизмы, оказывая бактериостатический эффект, подавляя их размножение, или бактерицидный эффект, вызывая гибель микробов.

Известны следующие основные механизмы антимикробного действия антибиотиков:

a. нарушение синтеза клеточной стенки бактерий (пенициллины, цефалоспорины);

b. нарушение проницаемости цитоплазматической мембраны (полимиксины);

c. нарушение биосинтеза белка (тетрациклины, аминогликозиды, левомицетин и др.);

d. нарушение синтеза ДНК (рифампицин).

Метод бумажных дисков

Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта. При определении лекарственной устойчивости используют чистую культуру возбудителя, выделенную до начала лечения антибиотиками, т. к. под их воздействием рост микроорганизмов может быть полностью угнетен. Изучение чувствительности проводят методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или методом серийных разведений в жидких и плотных питательных средах.

Метод бумажных дисков.Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар в чашке Петри.

На засеянную поверхность на одинаковом расстоянии друг от друга пинцетом помещают бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посев инкубируют при 37°С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чувствительности к антибиотикам.

Для получения достоверных результатов необходимо применять стандартные диски и питательные среды, для контроля которых используются эталонные штаммы соответствующих микроорганизмов.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов.

Оценка результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методами дисков и серийных разведений

Антибиотик	Метод дисков: диаметры зон задержки роста на среде АГВ (агар Гурьева-Васильева)	Метод серийных разведений: минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл
Устойчивые   (R)	Умеренно устойчивые (I)	Чувстви- тельные (S)	Устойчивые	Чувстви- тельные
Бензилпенициллин	≤ 20	21-28	≥ 29	-	≤ 0.1
Ампициллин	≤ 20	21-28	≥ 29	-	≤ 0.2
Карбенициллин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 32	≤ 16
Метициллин	≤ 13	14-18	≥ 19	-	≤ 3
Оксациллин	≤ 15	16-19	≥ 20	-	≤ 3
Цефалексин	-	-	-	≥ 32	≤ 10
Цефалотин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 32	≤ 10
Стрептомицин	≤ 16	17-19	≥ 20	≥ 15	≤ 6
Неомицин	≤ 12	13-16	≥ 17	-	≤ 10
Канамицин	≤ 14	15-18	≥ 19	≥ 25	≤ 6
Мономицин	≤ 13	14-17	≥ 18	-	≤ 10
Гентамицин	≤15		≥ 16	≥ 6	≤ 4
Тетрациклин	≤ 16	17-20	≥ 22	≥ 12	≤ 2
Эритромицин	≤ 17	18-21	≥ 22	≥ 8	≤ 2
Линкомицин	≤ 19	20-23	≥ 24	≥ 8	≤ 2
Левомицетин	≤ 15	16-18	≥ 19	≥ 16	≤ 8
Рифампицин	≤ 12	13-15	≥ 16	≥ 8	≤ 2
Полимиксин	≤ 11	12-14	≥ 15	≥ 50 Ед/мл	-
Ристомицин	≤ 9	10-11	≥ 12	-	≤ 5

Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундирующим в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений.

Метод серийных разведений

Данным методом определяют минимальную ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий концентрацию антибиотика (МИК). Вначале готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотика (мкг/мл или ЕД/мл) в специальном растворителе или буферном растворе. Из него готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10⁶-10⁷ бактериальных клеток в 1 мл. В последнюю пробирку вносят 1 мл бульона и 0,1 мл суспензии бактерий (контроль культуры).

Номер пробирки	Разведение антибиотика	Концентрация антибиотика, мкг/мл	Исследуемая культура, мл	Рост бактерий (помутнение среды)
	1:100		0,1	-
	1:200		0,1	-
	1:400		0,1	-
	1:800	12,5	0,1	-
	1:1600	6,25	0,1	+
	1:3200	3,12	0,1	+
	1 мл бульона без антибиотика	0,1	+ (контроль)

Посевы инкубируют при 37°С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательной среды, сравнивая с контролем культуры. Последняя пробирка с прозрачной питательной средой указывает на задержку роста исследуемой культуры бактерий под влиянием содержащейся в ней минимальной ингибирующей концентрации а/б.

Оценку результатов определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводят по таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штаммов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов.

К чувствительным относятся штаммы микроорганизмов, рост которых подавляется при концентрациях препарата, обнаруживаемых в сыворотке крови больного при использовании обычных доз антибиотиков. К умеренно устойчивым относятся штаммы, для подавления роста которых требуются концентрации, создающиеся в сыворотке крови при введении максимальных доз препарата. Устойчивыми являются микроорганизмы, рост которых не подавляется препаратом в концентрациях, создаваемых в организме при использовании максимально допустимых доз.

Схема описания антибиотиков

Название препарата ………………….

Классификационное положение:антибиотик (класс препарата)

Действующее начало: антибиотик (механизм действия на микробную клетку)

Получение: путем биосинтеза

полусинтетические

путем химического синтеза

Применение: 1) лечение инфекций;

2) определение чувствительности бактерий к антибиотику

Способ применения: 1) перорально, парентерально, местно;

2) in vitro, метод «бумажных дисков»

К работе № 3

Фаготипирование бактерий

По признаку специфичности различают следующие бактериофаги: поливалентные, лизирующие культуры одного семейства или рода бактерий; моновалентные, лизирующие культуры только одного вида бактерий; типовые, способны вызвать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры внутри вида бактерий.

Например, один штамм патогенного стафилококка может лизироваться несколькими типами фагов, поэтому все типовые фаги (24) и штаммы патогенных стафилококков объединены в 4 группы.

Метод фаготипирования имеет большое значение для эпидемиологического исследования, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. С этой целью определяют фаготип выделенной из патологического материала чистой культуры на плотных питательных средах с помощью типовых диагностических фагов. Фаготип культуры микроорганизмов определяют по тому типовому фагу, который вызвал ее лизис.

Схема описания бактериофагов:

Название препарата ………………….

Классификационное положение:бактериофаг

Действующее начало: бактериофаг

Получение: фильтрат фаголизата бульонной культуры соответствующего

микроорганизма

Применение: 1) лечебно-профилактические – для лечения и профилактики

соответствующих инфекций;

2) диагностические – для идентификации микроорганизмов (определение рода, вида, фаготипа)

Способ применения:1) орошение, полоскание, примочки, тампоны, инъекции, а также вводят в полости - брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь;

2) in vitro, реакция фаголизабельности или фаготипирования.

Занятие № 1.3.2

ВЛИЯНИЕ НА МИКРООРГАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ.

АНТИБИОТИКИ. БАКТЕРИОФАГИ

Цель занятия:

изучить характер влияния и механизмы действия биологических факторов на микроорганизмы; химиотерапевтические вещества.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Биологические факторы, влияющие на микроорганизмы.
2. Химиотерапия. Понятие о химиотерапевтических препаратах и химиотерапевтическом индексе. Принципы антимикробной терапии.
3. Микробный антагонизм, его механизмы. Микроорганизмы-антагонисты – продуценты антибиотиков.
4. Классификация антибиотиков по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия, способам получения.
5. Методы изучения антибиотикочувствительности бактерий.
6. Осложнения антибиотикотерапии, их предупреждение.
7. Бактериофаги (умеренные и вирулентные). Принципы применения в медицине.
8. Эубиотики (пробиотики).

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• определять чувствительность бактерий к антибиотикам и бактериофагам; расшифровать антибиотикограмму и определять минимально-подавляющую концентрацию антибиотиков.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ:

· методами микробиологических исследований с использованиеммедико-технической аппаратуры;

· применением эубиотиков для лечения, бактериофагов и антибиотиков для диагностики, профилактики и лечения; информацией о причинах возникновения, циркуляции антибиотикорезистентных микроорганизмов.

Работа № 1. Микробный антагонизм

Цель работы:изучитьявлениемикробного антагонизма между кишечной палочкой (штамм E. coli М-17) и вибрионом (водный вибрион).

Самостоятельная работа:а) зарегистрировать результат опыта совместного культивирования кишечной палочки и водного вибриона. Указать возможные механизмы микробного антагонизма. Зарисовать, сделать вывод.

водный вибрион

кишечная палочка

Результат:

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод: ______________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) объяснить назначение и механизм действия эубиотиков, классифицировать предложенные препараты. Результаты внести в таблицу.

Название	Действующее начало	Получение	Применение	Способ применения

Вывод: _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________