Разновидности иммунологических реакций

В данном разделе мы не в состоянии показать весь массив иммунодиагностических реакций, которых на сегодня более 200. Приводим выборочно реакции, в соответствии с систематикой (по одной или нескольким реакциям, практически по всем группам всех феноменов).

Феномен агглютинации

Прямой метод. Это процесс взаимодействия гомологичных антител и клеток (тканей, микроорганизмов, эритроцитов, тромбоцитов и пр.) с последующим выпадением комплекса в осадок (агглютинат).

Для постановки РА-реакции агглютинации необходимо:

1. Растворитель- 0,85 % раствор хлорида натрия.

2. Известную 2 % бактериальную взвесь.

3. Исследуемую сыворотку.

4. Предметные стекла, бактериологические петли, спиртовку.

5. Исследуемая культура.

6. Наборы агглютинирующих сывороток. Реакция агглютинации ставится в двух вариантах:в развернутом виде в пробирках и в виде ориентировочного метода – капельно на предметном стекле.

1. Развернутый вариант РА.

В настоящее время реакция не применяется.

2. Капельный вариант РА.

Применяют для быстрого определения антител в сыворотке крови путем постановки РА на предметном стекле при известном диагностикуме или типировании чистой культуры микробов при известной антисыворотке.

Типирование культуры: на предметное стекло наносят каплю известной сыворотки в разведении 1:10 (или по инструкции) и отдельно - каплю растворителя. В первую каплю вносят бактериальной петлей типируемую культуру микроба и распределяют ее по капле.

Петлю прожигают на спиртовке и вновь набирают культуру, распределяя ее во второй капле. Петлю прожигают и ставят на место. Через несколько минут проводят учет результатов.

Если типируемая культура гомологична по специфичности антителам в сыворотке, то будет наблюдаться агрегация, т.е. образование в капле хлопьев – это положительный результат.

При определении антител, также делают две капли: одна из исследуемой сыворотки, а вторая – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле бактериального диагностикума (1 млрд взвесь). Через несколько минут будет проявление результатов ориентировочной РА. В случае присутствия в исследуемой сыворотке антител, которые гомологичны диагностикуму, будет наблюдаться хлопьеобразование (это положительный результат). При отрицательном результате (отсутствие антител в исследуемой сыворотке) обе капли остаются равномерно мутными.

Непрямой метод. Ввиду значительного многообразия диагностикумов (латексных, эритроцитарных, Ко-, и др.), их необходимо классифицировать.

Различия диагностикумов определяются природой иммунологически активного агента, нагруженного на нерастворимый носитель.

Диагностикумы

иммуноглобулиновыеантительные антигенные

белковыенебелковые

Диагностикумы предназначены для выявления антигена и определения антител в различных выделениях человека, а также в биологических жидкостях с помощью простых и сложных иммунологических реакций.

1. РНГА - реакция непрямой гемагглютинации.

Для постановки реакции необходимо иметь:

1. Диагностический препарат.

2. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия, содержащий 2 % фосфатного буфера, рН 7,2 и нормальную лошадиную сыворотку в объеме 0,4 %.

3. Полистироловые панели, микропластины типа Такачи, градуированные пипетки, колбы, флаконы, пробирки, штативы.

4. Инактиватор для исследуемых сывороток.

5. Формалинизированные эритроциты барана, 50 % взвесь.

Постановка РНГА. Это двухкомпонентная реакция, осуществляется в 2 вариантах:в полистироловых панелях (макровариант), в микропластинах типа Такачи (микровариант).

1. Макровариант.

Постановка реакции осуществляется в 2 этапа.

1 этап. Готовят как обычно последовательные разведения сыворотки крови пациента в объеме 0,5 мл в лунках полистиролового планшета. Для этого во все лунки одного ряда планшета вносят растворитель по 0,5 мл, а в первую лунку 0,5 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:50. Из первой лунки 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, перемешивают и 0,5 мл переносят в третью и т.д. Последнюю лунку оставляют контрольной (без сыворотки). Сыворотку можно переносить пипеткой или дозатором на 0,5 мл.

2 этап. Антигенный эритроцитарный диагностикум (АЭД) добавляют во все лунки по 0,5 мл 0,5 % взвеси или по инструкции. Учет результатов через 1,5- 2,0 ч (см. таблицу № 17).

2. Микрометод. Готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,05 мл в микропланшете типа Такачи, как указано раньше. Перенос 0,05 мл по лункам осуществляется дозатором или смесителем с объемом головки на 0,05 мл. Последняя лунка - контроль. Во все лунки вносят по одной капле (0,025 мл) 0,5 % диагностикума. Учет реакции гемагглютинации через 1,5- 2,0 ч.

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Таблица № 17.

Схема постановки развернутого варианта РНГА

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, в мл
Исследуемая сыворотка, 1:50	1,0	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Растворитель	-	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Полученные разведения	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800	-
АЭД, 5 % взвесь	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0.025	0,025	0,025	0,025	0,025
Результат РНГА	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+	-	-
Титр РНГА	Титром РНГА является разведение сыворотки 1:3200

В первом и во втором случаях вместо исследуемой сыворотки можно титровать другой исследуемый материал - на антиген (копроэкстракт, мочу и пр.), а добавлять антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД).

Результаты РНГА учитывают по следующей схеме:

1. Агглютинат на ++++. Эритроциты покрывают все дно лунки широким "зонтиком".

2. Агглютинат на +++. Эритроциты покрывают почти все дно лунки.

3. Агглютинат на ++. Осадок небольшой, в центре лунки.

4. Агглютината на дне нет или он в виде маленькокого колечка. Это отрицательный результат.

Агглютинат в виде зонтика получается при положительном результате, когда антитела исследуемой сыворотки вступят в реакцию с антигенным диагностикумом. Если в сыворотке антител нет, то во всех лунках будет отрицательная реакция в виде маленького колечка.

С помощью РНГА можно определять до 15 тыс клеток (чумный микроб), до 1 млн клеток (эшерихии, протей и пр.) и более микробных тел или от 0,01 до 0,0001 мкг в мл растворимого антигена. Недостаток метода:из всей массы активных антител или антигенов определяется только их часть, так называемые полноценные или агглютинирующие. РНГА разработали в 1945 г. Миддлебрук и Дюбо.

Капельную постановку РНГА проводят в соответствии с описанной для РА, исключая типирование, диагностикум применяют не бактеральный, а АЭД.

Реакция Ко-агглютинации (РКоА).

Известна возможность поверхностного белка А золотистого стафилококка штамма Covan 1 соединяться с сайтом на Fc-фрагменте IgG человека, морской свинки и др. При этом Fab-фрагменты IgG с активным центром антител является свободным и доступным для взаимодействия с микробами, токсинами и пр. Таким образом, получают направленный антительный диагностикум, поскольку в остальных случаях приготовления диагностикумов антитела будут располагаться на носителе неупорядоченно.

Суточную культуру штамма Covan 1 смывают с агара 0,85 % раствором хлорида натрия и дважды отмывают путем центрифугирования при 3000 об. в мин в течение 15 мин, доводя взвесь бактерий до 10 %. Фиксируют и убивают клетки путем кипячения 1 мин.

К объему 10 % взвеси стафилококка добавляют равный объем иммунной сыворотки в разведении 1:20, специфичной к определяемому агенту в исследуемом материале (например, шигеллам зонне), истощенной (адсорбируемой) взвесью стафилококка сапрофита, с целью удаления антистафилококковых антител. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин и дважды отмывают при центрифугировании. Осадок стафилококка следует ресуспендировать, а затем консервировать азидом натрия до 0,1 %. Таким образом, был приготовлен антительный Ко-диагностикум.

На предметное стекло наносят две капли:первая капля - этоиспытуемый на шигеллы зонне копроэкстракт, а вторая капля – 0,85 % раствор хлорида натрия. В обе капли вносят по 1 капле приготовленного Ко-диагностикума. В течение 40-60 сек появляются хлопья (это положительная реакция в случае присутствия в материале шигелл зонне). В контроле будет равномерная муть. В случае отсутствия шигелл зонне (в нашем примере), то в опыте будет такая же равномерная мелкодисперсная муть, как и в контроле.

Торможение метода. Это сложные двухэтапные, многокомпонентные реакции.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Эта реакция относится к торможению прямой группы реакций, применяется в основном в вирусологии и также относится к феномену нейтрализации, где она и будет описана.

РТБА - реакция торможения бактериальной агглютинации.

Реакция не применяется.

РТНГА 1 - реакция торможения непрямой гемагглютинации 1. (Синонимы:РНАг - если диагностикум антительный, РНАт - если диагностикум антигенный).

Метод выполняют в 4 этапа.

1 этап. Предварительно выбирают рабочую дозу антисыворотки, путем постановки обычной РНГА с АЭД. Определяют титр данной антисыворотки (максимальное разведение, дающее положительный результат с АЭД). В качестве рабочей дозы используют разведение, которое в 3-4 раза концентрированнее, чем титр РНГА.

2 этап. Готовят последовательные разведения исследуемого материала на антиген как обычно, в объеме 0,25 мл в количестве 6 лунок в полистироловых панелях, оставляя шестую лунку контролем для диагностикума. В контрольный ряд вместо исследуемого материала вносят растворитель.

3 этап. Затем во все лунки двух рядов вносят антисыворотку к предполагаемому антигену в объеме 0,25 мл в рабочей дозе. Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

4 этап. После экспозиции во все лунки добавляют по одной капле 5 % взвеси антигенного эритроцитарного диагностикума, гомологичного по специфичности антисыворотке. Панель встряхивают и оставляют на 1,5-2,0 ч при комнатной температуре. В случае присутствия в материале антигена происходит нейтрализация в лунки антител известной антисыворотки, где антиген еще в значительной концентрации. В этих лунках будет отрицательной реакцией (таблицы 18 и 19).

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

В последующих лунках будет превалировать антисыворотка, поскольку антиген уменьшается ввиду его разведений в лунках. Это должно проявиться положительной реакций (РНГА). При отсутствии антигена в материале все лунки будут положительными по РНГА.

Таблица № 18.

Выбор рабочей дозы антисыворотки для РТНГА 1

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, мл
Известная сыворотка 1:100	1,0	-	-	-	-	-
Растворитель		0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Полученные разведения	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200
АЭД, 5 %	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	++++	++++	++++	++++	++++	-	-
Титр РНГА и рабочая доза антисыворотки	Титром антисыворотки является разведение 1:1600, а рабочая доза – (1:1600):3 = 1:533.

Таблица № 19

Схема постановки РТНГА 1

Ингредиенты	Номера лунок и количество ингредиентов, в мл
Растворитель	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Исследуемый на антиген материал, 1:10	0,25	-	-	-	-
Полученные разведения	1:20	1:40	1:80	1:!60	1:320
Антисыворотка в рабочей дозе	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
АЭД, 5 % взвесь	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	-	-	-	+++	++++	++++

РТНГА-2 (реакция торможения непрямой гемагглютинации).

1 этап. Готовят несколько идентичных рядов последовательных разведений известной антисыворотки в объеме 0,25 мл в полистироловых панелях. Количество рядов соответствует количеству проб на антиген и еше один - контрольный ряд.

2 этап. Во все лунки первого ряда вносят по 0,25 мл экстракта исследуемого материала на антиген, а во все лунки второго ряда - растворитель по 0,25 мл. Панели с лунками осторожно встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре.

3 этап. После этого во все лунки двух рядов вносят по одной капле 5 % взвеси АЭД, соответствующего по специфичности антисыворотке. Учет результатов проводят через 1,5-2,0 ч (таблица № 20).

В случае присутствия антигена в материале он нейтрализует антисыворотку и титр РНГА в первом ряду будет короче на несколько лунок, чем в контрольном ряду. В случае отсутствия антигена в материале титр РНГА в первом и во втором рядах будет идентичным.

Эти реакция (как и вся группа реакций метода) позволяет выявлять всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от РНГА, где выявляются агенты, которые имеют только полноценные свойства.

Таблица № 20.

Постановка РТНГА-2

Ингредиенты 1 ряд лунок	Номера лунок и количество ингредиентов, мл
1 ряд лунок
Антисыворотка		-	-	-	-	-	-	-
Растворитель	-	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Разведения	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800
Антиген 1:10	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
АЭД, 5 %	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	++++	++++	++++	+	-	-	-	-	-
2 ряд лунок
Растворитель		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Антисыворотка	0,5	-	-	-	-	-	-	-
Разведения	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
АЭД, 5 %	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025	0,025
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат РНГА	++++	++++	++++	++++	++++	++++	+++	-	-
Результат анализа	В материале есть антиген, на что указывает торможение РНГА в первом ряду на 4 лунки по сравнению со вторым рядом (титр РНГА 1 ряда 1:400, а второго – 1:6400)

Эти реакция (как и вся группа реакций метода) позволяет выявлять всю сумму антигена или антител, имеющих специфичность, в отличие от РНГА, где выявляются агенты, которые имеют только полноценные свойства.

При использовании антительного диагностикума возможно выявление антигена в РНГА и антител в сыворотке с помощью РТНГА. При использовании антигенного диагностикума возможно определять антитела в сыворотке при помощи РНГА и антигена в материале при помощи РТНГА. Это должно расширять ценность диагностикумов и выявляемость инфекционных больных.

Сорбционный метод. Составляют сложные многокомпонентные двухэтапные реакции.

РОГ - реакция определения гаптена.

1 этап. Готовят последовательные разведения (лучше в пробирках) исследуемого материала на антиген в объеме 0,5 мл на растворителе.

2 этап. Во все разведения вносят по 0,025 мл 0,5 % взвеси АТЭД . Смесь выдерживают 1,5-2,0 ч и учитывают результат. После учета реакции отбирают пробирки с отрицательной РНГА, отмывают антительный диагностикум в этих пробирках путем центрифугирования при 3000 об\ мин в течение 5 мин.

3 этап. К осадкам добавляют 0,5 мл иммунной сыворотки в рабочей дозе, по специфичности идентичной АТЭД. Результат учитывают через 1,5 - 2,0 ч.

В случае присутствия в материале неполноценного антигена, он будет реагировать с антительным диагностикумом, но не агглютинировать его. Внесение иммунной сыворотки резко изменит картину: взаимодействуя с неполноценным антигеном, сорбированном на диагностикуме, антитела добавленной иммунной сыворотки будут агглютинировать этот комплекс и будет получен положительный результат РНГА. Если неполноценного антигена (неагглютинирующего) в материале нет, то дополнительное введение иммунной сыворотки не приведет к агглютинации антительного диагностикума, т.е. РНГА будет отрицательной.

Метод разработан Ю.В. Канатовым (1984 г.) и имеет определенное значение при поиске чумного гаптена (неполноценного антигена) в заброшенных гнездах. В отличие от РНГА (выявляет полноценный антиген) и РТНГА (выявляет всю сумму антигена:полноценного и неполноценного), РОГ определяет только неполноценный антиген. Как видно, реакции не дублируют друг друга, но дополняют и расширяют диагностическую ценность методов и эритроцитарных диагностикумов.