Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней (по Теппер)

Из выкопанного монолита почвы с растениями стерильными пинцетом и ножницами отбирают 1 г молодых корней при­мерно одного диаметра с приставшими к ним частицами поч­вы.

Корни помещают в 1-ю колбу со 100 мл стерильной во­допроводной воды и взбалтывают 2 мин. Стерильным пинцетом, корни извлекают и переносят последовательно во 2-ю, 3-ю и т. д. до 6-й пробирки, содержащие по 9 мл стерильной водопро­водной воды. В каждой пробирке корни отмывают по 2 мин.

Из каждой пробирки отдельно стерильной пипеткой берут 0,1 мл отмывной воды, наносят на поверхность питательной пластины (МПА) и отдельным шпателем Дригальского, держа полуоткрытую чашку около пламени горелки, растирают. Чашки помещают в термостат при 28—30 °С, спустя 3—5 сут чашки анализируют.

По мере отмывания корней численность бактерий не убывает, а в ряде случаев — даже увеличивается. Это свиде­тельствует о тесной связи эпифитных микроорганизмов с тка­нями растений, для которых они служат естественным защит­ным барьером. В чашках с посевом из первых отмываний мно­го крупных колоний спороносных форм бактерий — это могут быть и почвенные обитатели. По мере отмывания количество колоний бациллярных форм уменьшается и возрастает число мелкоточечных колоний неспорообразующих форм рода Pseudomonas.

I. Для определения количества микроорганизмов в ризосфере и на корнях суспензию из 1-й колбы (1-го отмывания) допол­нительно взбалтывают 5 мин. Затем из нее готовят разведения, из которых делают поверхностные посевы. Посев производят из 4-го, 5-го и 6-го разведений. Для подсчета клеток в 1 г абсолютно сухой почвы ризо­сферы число колоний на чашке умножают на 10 (чтобы опре­делить их число в 1 мл) и на степень разведения, а затем делят на массу абсолютно сухой почвы ризосферы.

II. При определении количества микроорганизмов на 1 г кор­ней число колоний, выросших в чашке, умножают на 10 (чтобы опре­делить их число в 1 мл), на степень разведения и делят на величину массы сырых корней.

III. Исследование морфологии колоний.По истечению 3-5 суток на чашках анализируют различные 3-5 колонии по следующей схеме:

- величина колонии – точечные (D – меньше 1 мм), мелкие (D – 1-2 мм), средние (D – 2-4 мм), и крупные (D – 4-6 мм и более).

- форма колонии - округлая, амебовидная, ризоидная.

- оптические свойства – прозрачная, матовая, флуоресцирующая, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая.

- цвет – отмечают цвет колонии и выделение пигмента в среду.

- поверхность – гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая.

- профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, врастающий в агар и т. д.

- край колонии – ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и т. д.

- консистенция – маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая.

При описании края и структуры колонии чашки Петри, не открывая, помещают под микроскоп дном вверх.

IV. Исследование морфологии микроорганизмов.Морфологию бактерий изучают из отдельной колонии (выбранных и проанализированный по схеме приведенной выше). Окрашивание производят по Граму. Окрашенный препарат микроскопируют, пользуясь объективами ´40 и ´90. Просматривая препараты, делают зарисовки микроорганизмов, обращая внимание на форму, взаимное положение клеток и на соотношение размеров бактерий при разном увеличении микроскопа; определяют отношение к окраске по Граму. Подсчитывают количество колоний на чашке.

Материалы, представляемые в отчет по лабораторной работе

1. Описать последовательность проведения работ

2. Результаты работы записать.

3. Изложить выводы по работе.

ТЕМА 4

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЧЕЧНОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК МОРСКОЙ СВИНКИ МЕТОДОМ ТЕПЛОЙ ТРИПСИНИЗАЦИИ

Цель занятия:

· Получить почечную культуру клеток морской свинки методом теплой трипсинизации

Вопросы и задания для самоподготовки

1. Биогеохимические круговороты

2. Методы оценки геохимической деятельности микроорганизмов

3. Круговорот серы

4. Круговорот углерода

5. Парниковые газы

6. Экологические стратегии и биотические связи у микроорганизмов

7. Биотические связи с участием микроорганизмов

8. Симбиотические отношения между микроорганизмами.

9. Эволюционная роль симбиотических взаимоотношений с участием микроорганизмов

10. Значение коэволюции в симбиозах микроорганизмов с макроор­ганизмами

Оборудование и материалы

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Колбы, пенициллиновые флаконы.

5. Физиологический раствор.

6. Материалы (предметные стекла для микропрепаратов; пробирки стеклянные, вместимостью 15 мл; пипетки, вместимостью 1,0 и 5,0 мл с делениями).

Общие сведения

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК В ВИРУСОЛОГИ

Значение культуры клеток и тканей в диагностических виру­сологических исследованиях. Внедрение метода культивирова­ния клеток и тканей в вирусологию и диагностику вирусных болезней позволило не только познать глубже сущность виру­сов, но и расшифровать этиологию ряда болезней, создать вы­сокоэффективные противовирусные вакцины (живые и убитые) для профилактики их. Открытие Дж. Эндерсом и сотрудника­ми способности вируса полиомиелита размножаться в культуре клеток (фибробласты эмбриона человека) послужило началом широкого применения этой системы в вирусологии, а открытие цитопатогенного действия вируса западного лошадиного энце­фаломиелита способствовало практическому использованию его в диагностике инфекции.

Метод культуры клеток заключается в том, что от убитого животного как можно быстрее после клинической смерти берут ткань или клетки и до наступления биологической смерти по­мещают их в соответствующие питательные среды и условия, обеспечивающие поддержание процессов жизнедеятельности. Наряду с множеством других преимуществ метод культуры тканей относительно дешев и поэтому может быть использо­ван массово.

Разработка метода дезагрегации тканей ферментативным путем, усовершенствование методов культивирования клеток и состава питательных сред создали основы для широкого при­менения культуры клеток в изучении общих и частных проблем вирусологии, и в частности разработки методов лабораторной диагностики вирусных болезней. Успехи техники культивирова­ния культуры клеток позволили наблюдать не только видимые изменения в инфицированных культурах, но и привели к от­крытию гемадсорбирующих вирусов.

В настоящее время число вирусов, выделяемых с помощью однослойных культур, резко уменьшилось по сравнению с ко­личеством вирусов, открытых сразу же после получения вируса полиомиелита. Оказалось, что некоторые вирусы трудно изо­лировать в однослойных культурах. В таких случаях требуются более изощренные лабораторные методы, максимально при­ближающие условия культивирования вируса к естественным, например использование культур органов. Однако одно­слойные культуры клеток не утратили своего значения.

Чрезвычайно важную роль во внедрении техники культуры ткани в широкую вирусологическую практику сыграло исполь­зование в питательных средах антибиотиков и антимикотических препаратов. Это позволило проводить исследования большого масштаба без чрезвычайно трудоемкой работы по предупреждению микробной контаминации культур. Другими важными усовершенствованиями техники тканевых культур явились употребление веществ, позволяющих диспергировать клетки и производить перевивку их взвесью, получение одно­слойных культур клеток и введение в практику синтетических культуралъных сред постоянного химического состава, сво­бодных от ингибиторов, действующих на вирус. Разработка и применение простых методов культивирования фрагментов органов и тканей для выделения и выращивания вирусов также внесли большой вклад в изучение этиологии и патогенеза ви­русных инфекций.

Культура тканей позволяет получить достаточно чистый вирус (с небольшим количеством чужеродных антигенов), что очень важно при изготовлении сывороток и антигенов для серо­логических реакций. С помощью серийных пассажей вирусов в культурах клеток удается получать аттенуированные (апатогенные) штаммы, пригодные для производства вакцин.

В настоящее время в практической вирусологии широко используются не только первично-трипсинизированные, но и перевиваемые, и диплоидные клетки.