II. Поверхностное культивирование грибов в жидких средах

Данный способ культивирования используют для накопления токсических веществ микроскопических грибов в питательной среде с целью дальнейшего использования в экспериментах по определению фитотоксической активности.

Техника. На поверхность жидкой среды Чапека, содержащейся в колбах Эрленмейера, аккуратно высевают споры исследуемой культуры гриба. Культивирование проводят в термостате при 25-27^оС в течение определенного периода (7-10 дней). Длительность культивирования токсинобразующих грибов зависит от вида. Обычно интенсивный рост гриба сопровождается максимальным накоплением токсических веществ.

2 занятие

Цель занятия: изучение фитотоксических свойств микроскопических мицелиальных грибов.

Штаммы грибов: в работе используют мицелиальные грибы, относящиеся к родам Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Alternaria.

В качестве растительных тест-объектов используют семена кукурузы, изолированные листья растений табака и культуру Chlorella vulgaris.

Среды: агаризованная среда Чапека; жидкая среда Чапека; полноценная питательная жидкая среда (ППЖ); стерильная вода; агаризованная питательная среда для выращивания хлореллы (г/л): KNO₃ – 5,0; KH₂PO₄ - 0,3; MgSO₄^.7H₂O – 0,3; пептон - 5,0; глюкоза – 10,0; 1 мл раствора микроэлементов (H₃PO₃ – 0,5; CuSO₄ – 0,04; KI – 0,1; FeCl₃ – 0,2; MnSO₄ – 0,4; Na₂MoO₄ – 0,2; ZnSO₄ – 0,4); агар-агар – 15,0; рН 6,5.

Оборудование: бумажные фильтры или марлевые сита, чашки Петри, пробочное сверло диаметром 1-2 см, спиртовка, бактериологическая петля.

Задание на занятие:

1) учет результатов по определению токсичности исследуемых грибов на микроорганизмах;

2) определение фитотоксичности по отношению к высшим растениям (биопроба на проростках кукурузы; фитопроба на дисках из листьев и изолированных листьях табака);

3) определение фитотоксичности по отношению к водорослям (биопроба на Chlorella vulgaris).

Ход работы:

Определение фитотоксической активности грибов

Перед определением фитотоксичности культуральную жидкость исследуемого гриба отделяют от мицелия фильтрованием через бумажные фильтры или марлевые сита.

I. Определение фитотоксичности по отношению к высшим растениям

1. Биопроба на проростках кукурузы

Проростки кукурузы являются наиболее пригодными для первичного отбора грибов-продуцентов фитотоксинов, благодаря значительной скорости прорастания и роста (за сутки прирост достигает 5 см) и четкой зависимости роста от наличия в культуральной жидкости фитотоксинов. В работе используют проростки кукурузы с длиной корней 1-2 см.

Техника. Кончики корней (точку роста и меристематическую зону) проростков кукурузы помещают на 1 час в культуральную жидкость гриба. Контрольные проростки помещают в воду и стерильную питательную среду. После этого проростки раскладывают в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу, чашки помещают в термостат (25-26^оС). Через 24 часа культивирования измеряют длину корней в опыте и контроле и рассчитывают фитотоксическую активность корней (%) по формуле:

АФ=100 -	(ДX-ДН)*100
ДK-ДH

где Д_Х– средняя длина корней проростков через 24 часа в опыте (мм); Д_К– средняя длина корней проростков через 24 часа в контроле (мм); Д_Н начальная длина корней проростков (мм).

2. Биопроба на дисках из листьев и изолированных листьях растений

Техника. Из листьев растений табака одного возраста вырезают пробочным сверлом диски и смачивают их культуральной жидкостью исследуемых грибов (также можно использовать целые изолированные листья). Диски или листья помещают в чашки Петри на увлажненную водой фильтровальную бумагу и выдерживают несколько дней при температуре 20-22^оС. Контрольные чашки содержат диски или листья, не обработанные культуральной жидкостью. Через определенное время (3-5 суток) отмечают появление некротических пятен, ожогов, изменение цвета и другие изменения по сравнению с контролем.

II. Определение фитотоксичности по отношению к водорослям

Биопроба на хлорелле (Chlorella vulgaris)

Техника. Чашки Петри с агаризованной средой Чапека уколом инокулируют исследуемыми грибными организмами. Через 24-48 часов инкубирования в термостате при 26^оС эти же чашки заливают вторым слоем агаризованной питательной среды (1-3 мм), содержащей взвесь клеток хлореллы (смыв с одного косяка 3-5-дневной культуры, выращенной на той же среде, в 500 мл питательной среды) и ставят в светотеплицу с температурой 26^оС. Через 4-5 суток инкубирования вокруг грибов – продуцентов фитотоксических веществ – образуются ясно выраженные зоны отсутствия роста хлореллы.

3 занятие

Цель занятия. изучение антибиотических свойств микроскопических мицелиальных грибов-антагонистов.

Штаммы: в работе используют мицелиальные грибы, относящиеся к родам Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Alternaria. В качестве тест-объектов используют жидкие культуры Escherichia coli, Erwinia herbicola, Erwinia carotovora, Staphylococcus saprophyticus.

Среды: агаризованная среда Чапека, 1,2% ППА, 2% ППА, жидкая среда Чапека.

Оборудование: линейка, пробочное сверло диаметром 8 мм, бумажные фильтры или марлевые сита, микробиологический шпатель.

Задание на занятие:

1) учет результатов биопробы на проростках кукурузы и вычисление фитотоксической активности ингибирования роста корней по предложенной формуле;

2) учет результатов биопробы на дисках из листьев и изолированных листьях растений табака;

3) учет результатов биопробы на хлорелле;

4) определение антибиотической активности грибов при культивировании на плотных средах;

5)определение антибиотической активности грибов при культивировании в жидких средах.

Ход работы:

I. Определение антибиотической активности грибов на агаризованных средах

1. Метод агаровых блоков

а) Техника. Пробочным сверлом вырезают агаровые блоки из колоний гриба-антагониста, выращенного на агаризованной среде Чапека в чашках Петри. Блоки переносят на поверхность ППА в другой чашке Петри, предварительно засеянной одной из тест-культур. Чашки с агаровыми блоками помещают в термостат на 24 часа при температуре, оптимальной для развития тест-культуры. Если выделяемый грибом антибиотик подавляет рост тест-культуры, то вокруг агарового блока образуется зона отсутствия роста.

б) Техника. В центр чашки Петри помещают по одному блоку, вырезанному из колонии гриба-антагониста, затем в чашку наливают ППА с таким расчетом, чтобы уровень среды был на 1-2 мм ниже уровня блока. После застывания среды по радиусам агаровой пластинки высевают штрихами тест-организмы и чашки помещают в термостат на 24 часа. Отсутствие роста штриха тест-культуры на определенном расстоянии от блока указывает на угнетение ее антибиотиком, образуемым изучаемым грибом-антагонистом. Метод позволяет определить антибиотическую активность по отношению к нескольким тест-организмам.

2. Метод двойных пластинок

Метод двойных пластинок используется в том случае, если антагонист (гриб) и тест-культура (бактерия) требуют различных сред и температурного режима для своего развития.

Техника. Чашку Петри делят пополам стеклянной перегородкой. В одну половину вносят питательный агар с грибом-антагонистом, другую заливают стерильной агаризованной питательной средой, пригодной для развития тест-культур. После застывания среды на ее поверхность штрихами наносят тест-культуры. Метод позволяет определить антибиотическую активность по отношению к нескольким тест-культурам.

II. Определение антибиотической активности в жидких средах

Для определения антибиотической активности используют культуральную жидкость грибов-антагонистов, выращенных при температуре 26^оС в течение 10-15 дней поверхностным способом в жидких питательных средах.

1. Метод лунок

Техника. 1 мл жидкой тест-культуры вносят в 4 мл расплавленной и охлажденной до 45^о 1,2% питательной среды и заливают вторым слоем на поверхность 2% агаризованной среды того же состава в чашке Петри. После застывания среды в центре чашки вырезают лунку и вносят в нее 0,1 мл полученной после фильтрации через бумажные фильтры или марлевые сита культуральной жидкости исследуемого гриба-антагониста. После 24-48 часов культивирования в условиях, оптимальных для тест-культуры, измеряют зону задержки роста вокруг лунки.

2. Метод посева тест-культуры на среду с культуральной жидкостью

Техника. 5 мл культуральной жидкости гриба-антагониста смешивают с 10 мл расплавленного и охлажденного до 45^о питательного агара. Полученную смесь выливают в чашку Петри. После застывания среды на ее поверхность сплошным газоном высевается исследуемая тест-культура. В качестве контроля используется питательная среда, содержащая вместо культуральной жидкости гриба 5 мл стерильной воды. Зону задержки роста тест-культуры определяют в процентах от максимальной площади, которую она могла бы занять.

4 занятие

Цель занятия: учет результатов, полученных при изучении антибиотических свойств микроскопических мицелиальных грибов-антагонистов.

Штаммы: в работе используют мицелиальные грибы, относящиеся к родам Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Alternaria. В качестве тест-объектов используют жидкие культуры бактерий Escherichia coli, Erwinia herbicola, Erwinia carotovora, Staphylococcus saprophyticus.

Оборудование: линейка.

Задание на занятие:

1) учет результатов по выявлению антибиотической активности грибов при культивировании на агаризованных средах (метод агаровых блоков, метод двойных пластинок);

2) определение антибиотической активности грибов при культивировании в жидких средах (метод лунок, метод посева тест-культуры на среду с культуральной жидкостью гриба);

3) оформление на основании полученных результатов таблицы «Биологическая активность микроскопических мицелиальных грибов».

Программа спецкурса «Важнейшие группы эукариотических микроорганизмов»

Введение

Общая характеристика эукариотических микроорганизмов. Основные отличия клеток эукариотических микроорганизмов от прокариотических. Важнейшие группы эукариотических микроорганизмов и научное обоснование отнесения простейших, водорослей и грибов к эукариотическим микроорганизмам. Традиционная и современная классификационные схемы эукариотических микроорганизмов.

Простейшие (Protozoa)

Простейшие как объект микробиологии. Краткая характеристика основных типов простейших в соответствии с классификационной схемой; их клеточное строение, способы размножения, жизненные циклы, физиолого-биохимические особенности, основные типы питания и области распространения на примере важнейших представителей каждого типа. Простейшие как объект научных исследований. Практическое значение простейших.

Водоросли (Algae)

Общая характеристика водорослей как эукариотических микроорганизмов. Основные признаки, отличающие водоросли от высших растений и животных. Структурное разнообразие водорослей, особенности фотосинтетического аппарата, способы размножения, места обитания. Краткая характеристика основных отделов водорослей (Euglenophycota, Chlorophycota, Bacillariophycota, Chrysophycota, Xanthophycota). Сравнительная характеристика важнейших представителей основных отделов с учетом их морфологических и физиологических особенностей и циклов развития. Использование одноклеточных водорослей как модельных объектов в научных исследованиях. Значение водорослей в народном хозяйстве.

Грибоподобные протисты

Слизевики (Myxomycota)

Примитивная организация группы микроорганизмов, близких к грибам. Особенности строения и качественный состав вегетативного тела слизевиков. Плазмодий и склероций. Особенности полового и бесполого размножения слизевиков. Сапротрофные формы миксомицетов и облигатные внутриклеточные паразиты. Наиболее вредоносные для сельскохозяйственных растений виды: циклы и особенности развития, характер вызываемых ими заболеваний.

Акразиомицеты (Acrasiomycota)

Группа акразиевых как низшие микроорганизмы. Стадии и особенности развития, внешнее сходство и существенные отличия с истинными миксомицетами. Циклы развития и физиолого-биохимические особенности наиболее изученных представителей данного отдела эукариотических микроорганизмов.

Хитридиомицеты (Chytridiomycota)

Общая характеристика и классификация отдела. Основные особенности представителей отдела: степень развития вегетативного тела, способы размножения, образ жизни. Циклы развития, физиологические и морфологические особенности важнейших представителей. Большое практическое значение хитридиомицетов, как фитопатогенов. Так и паразитов животных.

Оомицеты (Oomycota)

Общая характеристика отдела. Строение вегетативного тела, особенности полового и бесполого размножения, строение и состав оболочки клеток, среда обитания. Принципы классификации отдела. Циклы развития и особенности жизнедеятельности важнейших представителей отдела. Экономическая важность некоторых оомицетов, являющихся активными паразитами высших растений и животных.

Грибы (Fungi, Mycota)

Основные принципы, лежащие в основе классификации грибных организмов. Традиционная и современная классификационные схемы грибов. Общие черты и существенные различия грибов и высших растений. Макро- и микромицеты. Микромицеты как эукариотичесие микроорганизмы. Эволюция грибов.

Основные типы питания грибов (сапротрофы, облигатные и факультативные паразиты, симбионты) и связанные с этим особенности их жизнедеятельности. Основные способы размножения грибов (вегетативное, бесполое, половое). Разнообразные формы и характерные особенности полового процесса у грибов. Важнейшие признаки, лежащие в основе классификации (особенности организации вегетативного тела, химический состав клеточных стенок, особенности размножения и жизнедеятельности, распространения в природе и образа жизни).

Зигомицеты (Zygomycota)

Общая характеристика отдела. Особенности полового процесса и бесполого размножения, строения мицелия, образа жизни. Принципы классификации. Народно-хозяйственное значение фитопатогенных грибов порядка Mucorales. Особенности строения, циклы развития и характер вызываемых ими заболеваний. Научный и практический интерес к грибам порядка Entomophthorales – паразитам насекомых: их жизненные циклы и физиолого-биохимические особенности. Характерные признаки данных грибов и узкая специализация к поражаемым видам. Возможность применения энтомофторовых грибов как средства биологической борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве.

Аскомицеты (Ascomycota)

Особенности организации мицелия аскомицетов, относящихся к высшим грибам. Особенности бесполого размножения. Формы полового процесса. Форма и строение асков, характер их формирования и размещение. Основы классификации аскомицетов. Циклы развития, характерные особенности жизнедеятельности и значение важнейших представителей данного отдела. Использование аскомицетов в генетических исследованиях. Порядок Endomycetales. Общая характеристика дрожжей. Особенности строения вегетативного тела и процессов размножения дрожжевых грибов. Практическое значение семейства Saccharomycetaceae. Использование дрожжей в микробиологическом производстве в качестве продуцентов биологически ценных веществ. Роль дрожжей в разработке общих проблем генетики эукариот. Дрожжи-сахаромицеты как важнейший объект генной инженерии.

Базидиомицеты (Basidiomycota)

Базидиомицеты как эукариотические микроорганизмы. Основная характеристика и систематика представителей отдела. Организация мицелия, морфологические и физиолого-биохимические особенности жизнедеятельности и особенности размножения; особенности полового процесса и циклы развития; биологическое и практическое значение и особенности образа жизни важнейших базидиомицетов.