Последовательность анализа ПЦР-ДНК Кейт

Поскольку правильный размер Ленты в Agarosegel несмотря на наличие искомого гена

указывает, но не представляет никаких доказательств, соответствующих банд из геля

вырезали и с помощью QIAquick Gel экстрагент-Kit (Qiagen) чистить. Которые

Секвенирование осуществлялось без предварительного клонирования для создания банды

используемых праймеров и был проведен компанией ЗАО Biosciences, Бремен.

Сравнение последовательности ПЦР-продуктов с положили в базах за

Последовательности произошел взрыв с помощью программы. Для оценки значимости одного

База обмена нуклеотидов последовательности было для бактерий действительный код

NCBI базе данных аминокислот в переводе (Jukes и Осава, 1993; Осава et al., 1992).

Для ответа на вопрос, является ли это для того, чтобы обменяли на аминокислоты договорная

физико-является химически связанных аминокислот или нет, произошло разделение

Аминокислот по следующей схеме (Taylor, 1986):

L, I, V гидрофобные алифатические AS ⇔ F, Y, W гидрофобных ароматических AS

N, Q полярный, amidische AS ⇔ S, T полярный, алкогольные AS

D, E, полярные, отрицательно заряженные AS ⇔ H, K, R полярные, положительно заряженные AS

A, G малый алифатические AS ⇔ M, C сернистые AS

P AS аминогруппы с

ДНК-последовательность анализа фаги P482

Добыча фаги в масштаб заготовил

Обогащение фаги P482 для извлечения ДНК для секвенирования осуществлялась

по сути, как у Sambrook et al. (1989) описали. 10 x 100 мл GM17-Medium

будут по 5 мл свежего восемь культуре чувствительных бактерий Районе высевались и племени

при 30°с до OD 0,3 - 0,4 bebrütet. Затем по 1 мл 40 мм CaCl2

и по 5 мл Phagenlysat (титр 10.7) и признался, вплоть до лизиса (OD 0,1-0,2) и инкубируют.

После объединения 10 культур 1 л Lysat кружева сравниться с лопаточкой и DNase

Азу добавляют и при 38°C 20 мин и инкубируют. После добавления NaCl до

Конечная концентрация 1 М взбудоражили фаги растворе в течение 1 ч на льду, а затем 10

мин при 4°C и 11.000 г центрифугируют. Осадок будет в 15 мл SM-буфера (10 мм NaCl, 0,8

мкм MgSO4 x H2O, 50 мм Трис, 0,1%желатина) решена.

Page 49

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

10% PEG6000 будет при Перемешивании в Ч2O решена, 1 ч на льду, а затем хранить 30 мин

при 4°C и 11.000 г центрифугируют.

В структуре CsCl2Градиенты 1 мл CsCl2-Раствор с плотностью δ=1,7; 2

мл раствора δ=1,5; 3 мл раствора δ=1,4; 3 мл раствора δ=1,3; 2-3 мл раствора δ=1,2 в

Пробирки центрифужные друг на друга и добавляет примерно с 5 мл Phagenlysat überschichtet. Которые

Отделения фаги осуществляется в поворотно-откидные ультра ротор центрифуги после 20 часов

Центрифугирование при 22.000 мин и 10°C.

Уборка фаги банда выполняется как в Sambrook et al. описано с помощью шприца и

последующий контроль на фаги в электронный микроскоп (Sambrook et al., 1989).

Те фаги в CsCl2 при 4°C и хранения.

Секвенирование фаги P482

Для привлечения фаги-ДНК фенол был изначально-хлороформ экстракции

проведена ДНК, а затем путем диализа Slide-A-Lyzer-Rähmchen (Pierce) в

Производителя обессоленной. Все дальнейшие действия по клонирования фаги ДНК происходили

аналоговый Sambrook et al. (1989) глава 2.80. С Sau3A или Taq I restringierte

геномная ДНК была)в векторы pZero 2.1 (Invitrogen) или pBluescript (Stratagene

клонировали. После трансформации плазмиды в E. coli k12 Наличие было

Вставки методом ПЦР проверить. ДНК-последовательность Вставки была от компании ЗАО

Bioscience GmbH определить с помощью устройства Секвенирования (от Abi 373A) . Расположение

из P482-фрагменты в Contigs осуществлялась с помощью программы Seqman (ДНК-Star, Laser гены

Inc., Мэдисон, штат Висконсин, США). К закрытию между Contigs существующих

Последовательности пробелов с помощью программы ClustalW (EBI), MultAlin (INRA) и

Genedoc 2.5. смещение с содержащейся в базах данных фаги последовательности 936

Виды выполняемых. Путем целенаправленного подбора праймеров в консервированной сильно, но еще

не из P482-известных местах могли одним зазоры между Contigs к

полной последовательности фаги P482 будут закрыты.

Сравнительный анализ ДНК

Для оценки последовательности фаги P482 в 2.3 описанной программы были

Пакеты и отдельные программы использует. Для проверки результатов, которая осуществлялась

Анализ последовательности если возможно с более чем одной программе. Так были ORFs

путем оценки результатов протоколов из программ ORF Finder и Omiga 2.0

Page 50

2. Материал и методы

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

предназначен. Промоутер последовательности были путем объединения программ Omiga 2.0

и промоутер Predictor определены. Кроме того, промотор из структур были рядом

родственники фаги, которые были описаны в литературе, в определении

Промоутер последовательности включиться. После выявления ORFs стал

Нуклеотидная последовательность перевести через программу "белка Machine" в и аминокислот

Молекулярный вес и isoelektrische точки предсказанных белков с

соответствующие инструменты Expasy-сервера определяет. С помощью программы Blast был

Сравнение аминокислотной последовательности в базах данных с наплавленного белков

выполнены. Для получения информации о функции прогноза белки

получить, были программы, такие как БЛОКИ, InterPro Sequence Analysis, PFAM и

Prosite использованы, которые ищут для классов Ферментов характерных аминокислотных мотивов.

ДНК-чип-гибридизации

Подготовка и подключение зондов на поверхности Чипа

В табл. 14 перечисленные зонды использовались в качестве исходного раствора с концентрацией

100 мкм в Сек2O решена. Разбавление происходило на рабочей концентрации 10 мкм

также в Ч2O с 1% глицерина. Для очистки скважин Millipore Ultra Free были-

Так КАК титр плиты (Cat.nr. 42600). 200 мкл зонда рабочего раствора при 15 мин были

1000 об / мин в центрифуги Eppendorf с поворотно-откидной ротор для микропланшетов через плиты

Блок фильтра в новый микротитровальных пластины (Nunc, heat устойчивы) центрифугируют. Так

подготовленные зонды могут либо непосредственно в пипетирования робот RoboDrop

(Собственная разработка центра прикладной Gensensorik) используется или при -20°C

храниться.

Подключения Oligonukleotide на поверхности Чипа произошло после нанесения

Зонды с помощью пипетирования робота на ночь во влажной камере. Для удаления не-

подгонянная зондов и химической дезактивации поверхности были фишки

один раз с амино hexanol (117,19 г/моль) промывают и затем 1 ч выдерживают в нем.