Шляхи підвищення біосинтезу антибіотиків

Існує два способи підвищення біосинтетичної активності продуцентів антибіотиків:

1. Отримання з вихідних штамів мутантних форм, які мають підвищену активність до синтезу антибіотика.

2. Підбір умов культивування, найбільш сприятливих для максимального утворення антибіотиків.

Виділяють декілька шляхів підвищення ефективності штамів-продуцентів антибіотиків:

1. Спонтанні мутації (класичний). У той час, коли встановили антибактерійну дію пеніциліну і можливість його використання в якості лікарського засобу (Х.У. Флорі, Е.Б. Чейн та ін., 1941), продуктивність лабораторного штаму плісені (2 мг препарату на 1 л культуральної рідини) була недостатньою для налагодження промислового виробництва антибіотика. Багаторазовими систематичними впливами на вихідний штам Penicillium chrуsogenum такими мутагенами як рентгенівське та ультрафіолетове опромінення, азотистий іприт у сполученні зі спонтанними мутаціями і відбором найкращих продуцентів, вдалося збільшити продуктивність гриба в 10000 разів і довести концентрацію препарату в культуральній рідині до 2 %.

Шлях підвищення ефективності штамів-продуцентів антибіотиків, заснований на спонтанних мутаціях, що став класичним, не дивлячись на трудомісткість і дуже великі витрати часу, використовується до цього часу. Антибіотик, на відміну від білка, не є продуктом вираження певного гену, біосинтез антибіотика відбувається в результаті спільної дії 10-30 різних ферментів, які кодуються відповідною кількістю різних генів. Крім того, для багатьох антибіотиків, мікробіологічне виробництво яких налагоджене, молекулярні механізми їх біосинтезу до цього часу не вивчені. Полігенний механізм, на якому базується біосинтез антибіотиків, є причиною того, що зміни окремих генів не можуть бути успішними.

2. Генноінженерний підхід передбачає конструювання продуцентів з використанням плазмід у якості вектора для створення рекомбінантних ДНК, які включають гени, що контролюють біосинтез ферментів, які каталізують реакції синтезу антибіотиків, поки встановлено тільки у продуцентів метиленоміцину. В інших випадках плазмідам відводиться роль регуляторів активності генів, локалізованих у хромосомах. Однак у більшості штаммів мікроорганізмів, що використовуються для отримання антибіотиків у промислових масштабах, плазміди поки виявити не вдалося.

3. Мутасинтез (мутаційний біосинтез). Мутанти мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків інколи утворюють біологічно активні проміжні продукти якогось певного шляху біосинтезу антибіотика або речовини, які можуть бути корисними як попередники при створенні нових аналогів антибіотиків. «Блоковані» мутанти цього типу не здатні утворювати потрібний антибіотик, якщо у середовищі культивування немає метаболічного попередника, який в нормі утворюється за участю фермента. Оскільки ферменти, що беруть участь у вторинному метаболізмі, часто мають відносно низьку субстратну специфічність, то аналоги попередників антибіотиків можуть бути легко перетворені мутантом в аналоги самого антибіотика в ході мутаційного біосинтезу.

Виробництво вітамінів

Вітаміни – низькомолекулярні органічні речовини, які в низьких концентраціях мають високу біологічну дію. Джерелом вітамінів у природі є рослини і мікроорганізми. Препарати вітамінів у промисловості одержують двома способами:

· хімічним – переважну більшість препаратів вітамінів;

· мікробіологічним – препарати вітамінів В₁₂ (цианкобаламін), В₂ (рибофлавін), ергостерин, каротиноїди.

Світове виробництво вітаміну В₁₂ становить 9–11 т/рік, з них 6,5 т використовують для медичних цілей, а решту – для тваринництва. Основними продуцентами вітаміну В₁₂ є пропіоновокислі бактерії – Propionibacterium freudenreichii та Pseudomonas denitrificans.

Сировиною для культивування продуцентів вітаміну В₁₂є соєва та рибна мука, м’ясний та кукурудзяний екстракти, спирти – ізопропанол, метанол і пропандіол. Необхідними компонентами при виготовленні середовища є солі кобальту і амоній сульфат.

Схема виробництва препаратів вітаміну В₁₂ при використанні пропіоновокислих бактерій:

1. Культивування здійснюється періодичним способом у анаеробних умовах. Обов’язково контролюють рН середовища (утворену кислоту нейтралізують, додаючи луги). Через 72 години в середовище культивування вносять попередник вітаміну В₁₂– 5,6 диметилбензімідазол. Без внесення цієї сполуки бактерії синтезують кобінамід і псевдовітамін В₁₂ (азотистою основою є аденін), які не виявляють біологічної активності та не мають практичної цінності.

2. Через 72 години в клітинах нагромаджується В₁₂ і ферментацію завершують. Проводять сепарування біомаси і екстракцію вітаміну з неї водою, підкисленою до рН 4,5–5,0 при 85–90⁰С протягом 60 хв. Як стабілізатор додають розчин 0,25 % NaNO₂. За таких умов вітамін В₁₂ переходить у розчин.

3. Водний розчин охолоджують, доводять рН до 6,8–7,0 50 % NaОN. Для коагуляції білків до розчину додають Al₂(SO₄)₃ x18H₂O і безводний FeCl₃, після чого суміш фільтрують через прес-фільтр.

4. Очищають розчин, використовуючи іонообмінні смоли СГ-1, після чого кобаламін елюють за допомогою розчину аміаку.

5. Далі проводять додаткове очищення водного розчину вітаміну органічними розчинниками, випарювання і очищення на колонці з Al₂O₃, після чого кобаламін елюють водним ацетоном. При цьому вітамін відділяється від СN- і оксикобаламіну.

6. До водно-ацетонового розчину вітаміну додають ацетон і витримують 24–48 годин при температурі +3–4⁰С. Кристали вітаміну відфільтровують, промивають сухим ацетоном та сірчаним ефіром і висушують у вакуумному ексикаторі над Р₂О₅.

Щоб запобігти руйнуванню вітаміну В₁₂ всі операції проводять у затемненому приміщенні або при червоному світлі.

Рибофлавін (вітамін В₂) отримують за допомогою мікробіологічного синтезу, але основну частку виробництва становить хімічний синтез.

Промисловими продуцентами вітаміну В₂ є дріжджоподібні гриби Eremothecium ashbyii, Ashbyii gossupii, дріжжі Candida famata, генно-інженерні штамибактерій Bacillus subtilis.

Сировина різна, залежно від продуцента. Якщо продуцентом є Eremothecium ashbyii –основним компонентом середовища у ферментері є кукурудзяна і соєва мука, кукурудзяний екстракт, буряковий цукор, технічний жир, КН₂PO₄, CaCO₃, NaCl. Середовище стерилізують при 120–122⁰С протягом години. Культуру культивують періодичним способом у аеробних умовах при температурі 28-30⁰С до початку спороутворення. За таких умов утворюється 12 мг/мл вітаміну.

При використанні Bacillus subtilis – середовища включаємелясу, білково-вітамінний концентрат, або дріжджовий екстракт.

Рибофлавін використовують для лікування захворювання печінки і підшлункової залози, для вітамінізації деяких сортів хліба. Наявність вітаміну В₂ у кормах значно підвищує яйценосність курей, виживання курчат і ваговий приріст, тому препарати В₂ входять до складу комбікормів.

Ергостерин(вихідний продукт для одержання деяких стероїдних гормонів, жиророзчинного вітамінуD_2, лікувальних та харчових препаратів).

Продуценти–Saccharomyces cerevisiae, грибир. Aspergillus, Penicillium.

Культивування дріжджів ведуть при оптимальній температурі і гарній аерації (до 2 % кисню), середовище повинно містити надлишок джерела вуглецю (співвідношення C:N є Культивування дріжджів ведуть при оптимальній температурі і гарній аерації (до 2 % кисню), середовище повинно містити надлишок джерела вуглецю (співвідношення C:N є вихід продуктів залежить від тривалості опромінення, температури, наявності добавок.

33. Основними продуцентами вітаміну В₁₂ є пропіоновокислі бактерії – Propionibacterium freudenreichii та Pseudomonas denitrificans Промисловими продуцентами вітаміну В₂ є дріжджоподібні гриби Eremothecium ashbyii, Ashbyii gossupii, дріжжі Candida famata, генно-інженерні штамибактерій Bacillus subtilis.Ергостерин- продуценти–Saccharomyces cerevisiae, грибир. Aspergillus, Penicillium.

34.Кормовий препарат вітаміну В₁₂ отримують шляхом термофільного метанового бродіння спиртової і ацетоно-бутилової барди (відходи ацетоно-бутилового виробництва). Для зброджування використовують змішану культуру термофільних матанутворюючих бактерій.

Схема виробництва кормового концентрату вітаміну В₁₂

1. Зброджування барди у залізобетонних ферментерах безперервним способом протягом року. Контролюють рівень жирних кислот і амонійного азоту.

2. До барди у ферментер додають 4 г/л кобальт хлориду і 5 г/л метанолу, які стимулюють синтез кобаламінів. Перед випарюванням до збродженого середовища додають хлоридну чи фосфатну кислоту (рН 6,3–6,5), оскільки вітамін В₁₂ при нагріванні у лужному середовищі інактивується.

Метанову бражку концентрують і висушують на розпилюючій сушарці. Готовий препарат – порошок коричневого кольору з кислим смаком. Препарат фасують по 15 кг. Термін зберігання 12 місяців.

Кормовий препарат рибофлавіну –продуцент Eremothecium ashbyii.Ферментацію проводять глибинним способом у ферментерах за температури 28-30⁰С, інтенсивному перемішуванні та аерації.

Сировиною є глюкоза, мальтоза або кукурудзяна мука. Культуральну рідину після ферментації випарюють у вакуумі до 30–40 % сухих речовин. Сироп висушують у розпилюючій сушарці й отримують готовий продукт.

35.Каротиноїди– це основні харчові барвники. Вони інгібують розвиток ракових клітин шкіри, індукованих УФ-променями.

Продуценти – дріжджі Rhodotorula gracilis і гетероталічний гриб Blakeslea trispora.

Середовище для культивування містить кукурудзяно-соєву та рослинні олії, поверхнево- важливим фактором). Ростучу культуру опромінюють УФ-променями (280–300 нм). Склад і активні речовини і спеціальні стимулятори, які впливають на синтез того чи іншого виду каротиноїду.

Бета-каротин (провітамін А) виробляють в Україні з гриба Blakeslea trispora глибинним способом на середовищах із мелясою, соєвою олією, кукурудзяним екстрактом (схема отримання подібна до вітаміну В₂).

Микробиологический синтез каротиноидов.

Наиболее перспективными продуцентамидля биосинтеза каротиноидов являются бактерии, дрожжи (чаще всего на практике применяют дрожжи родаCandida, которые хотя и синтезируют небольшое количество каротиноидов, но отличаются высокой скоростью роста и способностью хорошо утилизировать разнообразные источники сырья) и мицелиальные грибы. Более часто на практике применяют зигомицетыBlakesleatrisporaиChoanephoraconjuncta. Спаривающиеся (+) и (-) особи этих видов при совместном культивировании могут образовывать 3 – 4 г каротина на 1 л среды.

Питательные среды для развития микроорганизмов-продуцентов достаточно сложны по составу, они включают в себя источники углерода, азота, витаминов, микроэлементов, специальных стимуляторов (гидрол, кукурузно-соевая мука, растительные масла, керосин, -ионон или изопреновые димеры и т.п.).

Вследствие того, что в клетках микроорганизмов образуются активные комплексы гидролитических ферментов, они способны утилизировать в качестве источников углерода различные субстраты – гидролизаты растительных отходов, мелассу, низкомолекулярные спирты и т.п. В качестве источника азота в питательную среду добавляют дрожжевой или кукурузный экстракт, соли аммония; при этом соотношение углерода к азоту должно составлять 320-400. Также кроме источников углерода и азота в питательную среду добавляют фосфор, калий, магний, цинк, железо, марганец, витамины группы В, токоферол.

Стимуляторы каротинообразования целесообразно вносить в культуральные среды в конце тропофазы, то есть когда продуцент переходит в продуктивную фазу (идиофазу).

Вначале штаммы микроорганизмов-продуцентов выращивают раздельно, а затем – совместно при 26 С (т.к. при более высокой температуре уменьшается выход целевого продукта процесса и ухудшается его качество) и усиленной аэрации (т.к. для окисления углеродных субстратов необходим кислород) с последующим переносом в основной ферментер. Условия культивирования сохраняют прежними.

В процессе выращивания вначале наблюдается интенсивный рост микроорганизмов и незначительный синтез каротиноидов. Усиленный синтез каротиноидов отмечается в начале стационарной фазы развития микроорганизмов. Длительность ферментации – 6 – 7 дней.

По окончании стадии ферментации, каротиноиды извлекают ацетоном (или каким-либо другим полярным растворителем), переводят в неполярный растворитель. В случаях извлечения белково-каротиноидных комплексов, то применяют поверхностно-активные вещества в концентрации 1 – 2 %. В целях очистки и более тонкого разделения гомологов можно прибегнуть к методам хроматографии или к смене растворителей.

Витамин А1 из-каротина сравнительно легко можно получить путем гидролиза последнего.

В случае изготовления каротинсодержащей биомассы для скармливания животным и птицам возможно ее сочетанное применение с витамином А или без него.

В медицинских целях витамин А изготавливают в капсулах для приема через рот.