Р-ция непрямой (пассивной)гемагглютинации,РКОА

Реакция агглютинации

Агглютинация -склеивание и выпадение в осадок микробных тел, при взаимодействии их с агглютининами. Агглютинины сод-ся в крови чел и жив., перенесших инфекцию. Постановка развернутой р-ции: компоненты- 1.сыворотка крови (0,1мл) 2. изотонич р-р хлорида натрия 3.корпускулярный Аг. Приготовление: ряд разведений 1:50 до 1:3200. 2 посление пробирки -контроли. Кроме 1 и последн наливают изотон р-р.,Затем из 1, берут 3мл и по 1мл наливают в 1,2, и последн., Далее из 2пробирки 1 мл в 3, из 3 в 4, 4в5, из 5 в дезинфецир р-р, (тоесть пол-ся ряд 2ухкратных разведений), Затем во все кроме последней добавл Аг. Жидкость мутнеет. Затем встряхивают и ставят на 2ч, t 37гр. Учитывают предварит рез-т. Через18-20ч окончательный. Положителньый рез-т — образование на дне осадка,,с просветлением надосадочной жидкости. Остаток на дне — агглютинат. (различают мелкозернистую(О)(кучка) и хлопчатую(Н)(зонтик) аггл-цию. Р-ция считается положит, если в контрольных пробирках жидкость однородно в 1- мутн. Во 2- прозрачн. Ориентировочная р-ция аг-ци: ( определение микроба) на стекло наносят 2 капли агглютин. сыворотки и 1 каплю изот р-ра. На расстоянии др. от др. Затем в 2 капли вносят бакт. Культуру.а ко 2 капле кульуру не доавл. Перемешивают, при комн.темпер, рез-т учит с пом. лупы ч-з 5-10мин.Положителньая р-ция — склеивание в виде зерн или хлоп. Групповая р-ция аг-ции нек-ые МО содержат групповые Аг.. При парентеральном введние бактер.в орг-ме появл. Антитела-агглютинины: специфические соотв видовым Аг, и не специф. возникающие под действ групповых Аг. Сыворотка сод. групповые агглют-ны агглютинирует родств микроб виды. - это и есть групповая р-ция.

2.Р- ия преципитация, ее механизм.

Реакция преципитации относится к числу наиболее простых и ускоренных методо серологического анализа. В основе реакции лежит образвоание видимого осадка, состоящего из вступивших друг с другом в соединение антител и молекулярных антигенов (например, бактериальн. белков или полисахоридов, образовавшихся при разрушении микробных тел).

Р-ция преципитации является качесвенным методом исследования, при котором диагностические значение имеет появление осадка в реагирующих жидкостях.

Р- ию преципитации используют в след. целях:

Для выявления специфич антител в исследуемой сыворотке на основе применения определенных антигенов

Для обнаружения антигенов белковой или полисахаридной природы с использованием известной, специфической, преципитирующей сыворотки.

Для постановки р-ции преципитирующей необходимо:

Сыворотки (исследуемые или иммунные- преципитирующие)

Антигены (исследуемые иди диагностические)

Изотонический раствор хлорида натрия рH 7,0-7,2

Пастеровские пипетки

Преципитационные пробирки (диаметром 2-3 мм и высотой 2-3 см для р-ции кольцепреципитации, диаметром 4 мм и высотой 4-6 см для р-ции преципитации по типу флокуляции)

Антигены, применяемые для постановки р-ции преципитации, представлят собой, коллоидные в-ва в состоянии тонкой дисперсности, обязательно должно быть в растворимом состоянии. В качестве антигенов в р-ции приципитации использ фильтраты бульонных культур, экстракты микробных тел, полученные различными способами.

Преципитирующие сыворотки, приготовленные против различных видов микробов, реагируют с антигенами, полученными только от этих видов микробов.

При постановке р-ции преципитации титр преципитирующих сывороток определяют по наибольшому разведению, антигена, при котором еще наблюдается образование преципитата.

Техника постановки р-ции преципитации:

В штатив устанавливают 2 ряда преципитационных пробирок. В пробирках первого ряда готовят несколько последовательных разведений антигена (степень начального и конечного, разведений определяется способом приготовления и активностью антигена). Экстракты микробных культур разводят обычно от 2 до 64 раз.

В каждую пробирку второго параллельного ряда вносят 0,5 мл цельной или разведенной 1:2 преципитирующ сыворотки. Затем разведенный антиген, находящий в пробирках первого ряда, переносят в объем 0,5 мл в соответствующие пробирки второго ряда.

Смесь антигена с сывороткой после тщательного перемешивания ставят на 2 ч в термостат, а затем на 18- 20ч оставляют при комн. Температуре.

В случае положительного результата в прозрачной жидкости образуются хлопья преципитата, оседавшие в виде рыхлого осадка на дно пробирки. Предельное разедение антигена, с которым сыворотка образет преципитат, считается титром сыворотки.

Различают след. методы постановки р-ции преципитации

Метод простой диффузии, при котором одно реагирующее в-во(обычно антиген) диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию др реагирующего в-ва, - иммунную сыворотку

Метод двойной диффузии , при котором антиген и антитело, движутся навстречу др другу через нейтральный слой агара

Р-ция непрямой (пассивной)гемагглютинации,РКОА

Сущность непрямой, или пассивной, р-ции гемагглютинации заключается в том, что эритроциты, обладая способностью адсорбировать на себе антигены, становятся «чувствительными» (сенсибилизированными) к соответствующей иммунной сыворотке. Под воздействием специфических антител сенсибилизированные эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне пробирки гемагглютинат.Отличаясь высокой чувствительностью и специфичностью, РНГА позволяет обнаруживать минимальные кол-ва антител и неполноценные антигены полисахаридной природы.Для постановки РНГА требуются:Сыворотка, подлежащая исследованию.Растворимый антиген для сенсибилизации эритроцитов.ЭритроцитыИзотонический раствор хлорида натрияР-цию непрямой гемагглютинации ставят в пластинках из органического стекла с лунками.Подготовка эритроцитов для постановки РГА. Для постановки этой р-ции пользуются свежими или консервир эритроцитами барана,быка или человека, полученными из дефибринированной крови. Из крови берут осадок эритроцитов в объеме 0,1- 1 мл и 2-3 раза отмывают его от остатка сыворотки в десятикратном объеме стерильного изотонического р-ра хлорида натрия.Отмытые эритроциты могут быть использованы в течении 48ч. После промывания эритроц приступают к сенсибилизации их антигеном. Отмытые эритроц мешивают с антигеном, кол-во которого определяется его качеством и способностью адсорбироваться на эритроцитах. Смесь антигена с эритроцитами помещают в термостат на 1 -2ч после инкубации взвесь сенсибилизированных эритроцитов центрифугируют, отмывают изотоническим раствором хлорида натрия и из осадка готовят 0,5- 1% взвесь эритроцитов для постановки р-ции геммаглютинации. Приготовленная взвесь может хранится в холодильн при t 3-4 С до появления признаков гемолизаПостановка р-ции. Приготовленные разведения сыворотки разливают в лунки по 0,5 мл. к каждому разведению исслед. Сыворотки + от 0,1 до 0,5 мл 0,5- 1% взвеси; сенсибилизиров эритроцитов.Каждый опят сопровождается постановкой котролей на отсутствие спонтанной агглютинации (1 и 2) и контролем на специфичность р-ции (3и 4)0,5 мл изотонич р-ра хлорида натрия + рабоч доза сенсибилиз. Эритроцитов0,5 мл изотонич р-ра хлорида натрия+ рабочая доза несенсибилизированных эритроцитов.Иммунная сыворотка, взятая в разведении, соответствующем ее титру (последн разведение, дающее положит р-цию в РНГА), нерабочая доза сенсибилизированных эритроцитов.Нормальн сыворотка, не содержащ специфич антител+ рабоч доза несенсибилизир эритороцитов.Результат р-ции геммагл учитывают после осаждения эритроцитов в контр пробирках непосредственно после инкубации в термостате при t 37СРезультат оценивают по внешнему виду осадка эритроцитов в лунках. В положительн случае +, эритроциты равномерно в виде «зонтика» покрывают почти все дно пробирки. При отрицательном результате (-) эритроциты оседают в зависимости от дна пробирки в форме компактного комочка , «пуговки»Р-ция коагглютинации (РКОА)Р-ция использ для индикации и типирования корпускулярных и растворимых антигенов. Преимущества р-ции- специфичность, простота постановки, экономичность.Сущность р-ции- белок А, нахалодящийся на поверхности золотистого стафилоккока, селективно реагируют с Fc- фрагментом lg1. Lg2.lg4, в результате чего остаются свободными антидетерминанты антител (Fab-фрагмент), который взаимодействуют с гомологичными антигенами и вызывают агглютинацию стафилококков. Компоненты р-ции:Коммерческие стафилококковые реагентыРастворимый антиген или исследуемая культураПостановка р-ции:Р-ия ставится на пластинках или предметных стеклах. К стафилококковому реагенту добавляют 0,1 мл исследуемого культуры или растворимого антигена, осуществляют инкубирование при комнатной t в течении 10- 30 мин. В положит случае отмечается образование агглютинации в капле.