Стандарты для нитратредуктазного теста
Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по выявлению способности микобактерий восстанавливать нитраты, рекомендуется использовать заранее приготовленную серию стандартов, соответствующих различной активности нитратредуктазы. Активность этой ферментной системы выражается в интенсивности окраски – от "+/–" до "5+" (см. выше). Эти стандарты можно хранить неопределенно долго и использовать при каждой постановке нитратредуктазного теста.
Реагенты
Растворы:
1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г безводного Na2HPO4 на 1000 мл воды)
2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г КН2PO4 на 1000 мл воды)
3. 0,067 М раствор фосфата натрия трехзамещенного (25,47 г Na3PO4 •12 Н2О на 1000 мл воды)
4. 1% спиртовой раствор фенолфталеина (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)
5. 1% спиртовой раствор бромтимолового синего (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)
6. 0,01% раствор бромтимолового синего: 1,0 мл 1% раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды.
Рабочий буферный раствор: Смешивают 35 мл раствора №1, 5 мл раствора №2 и 100 мл раствора №3.
Методика
В штатив ставят 8 чистых пробирок (пробирки №№ 1 -8).
Вносят 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с №2 до №8).
К 10 мл рабочего буферного раствора добавляют 0,1 мл раствора №4 и 0,2 мл раствора №6.
Вносят 2 мл раствора №7 в пробирку №1. Это цветовой стандарт, соответствующий реакции максимальной интенсивности ("5+").
В пробирку №2 вносят 2 мл раствора №7, хорошо перемешивают и переносят 2 мл в следующую пробирку (№3).
Продолжают серию двукратных разведений вплоть до пробирки №8, из которой выливают 2 мл смеси.
В результате будут получены следующие цветовые стандарты:
пробирка №1 – 5+
пробирка №2 – 4+
пробирка №3 – 3+
пробирка №5 – 2+
пробирка №6 – 1+
пробирка №8 – +/-
Пробирки автоклавируют, закрывают их герметично и хранят при 5°С.
Каталазный тест
Принцип метода. Каталаза – это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е. обеспечивать следующую химическую реакцию: 2Н2О2 = 2Н2О + О2. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды микобактерий обладают каталазной активностью, за исключением M. bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов M. tuberculosis.
В клетках микобактерий присутствует ряд изоферментов каталазы, различающихся по термостабильности. Необходимо отметить, что нетуберкулезные микобактерии и некоторые сапрофиты синтезируют термостабильную каталазу.
При изучении каталазной активности микобактерий используют как качественные, так и количественные тесты:
- качественный (капельный) тест, указывающий на наличие каталазы (выполняется при комнатной температуре);
- полуколичественный тест, указывающий на уровень каталазной активности (измеряется высотой столбика пузырьков в пробирке);
- тест на термостабильность каталазы – тест определения наличия каталазы при 68°С и рН 7,0.
Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы M. tuberculosis продуцируют каталазу, активность которой можно определить капельным методом. При постановке полуколичественного теста столбик пузырьков газа не превышает 45 мм. После прогревания бактерий при 68°С и рН 7,0 в течение 20 минут микобактерии комплекса M. tuberculosis дают отрицательный результат.
Для постановки каталазных тестов следует использовать двухнедельные культуры, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена при 35–37°С. Для выполнения указанных тестов пробирки с питательной средой помещают в свертыватель для коагуляции в вертикальном положении. При инкубации в стандартных условиях пробирки должны быть закрыты пробками. Продолжительность инкубации - 14 дней.
Реактивы
0,067 М фосфатный буферный раствор, pH 7,0
Раствор1: Растворяют навеску Na2НРО4 9,47 г в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы получить 0,067 М раствор.
Раствор 2: Растворяют навеску КН2РО4 9,07 г в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы получить 0,067 М раствор.
Для получения 0,067 М фосфатного буфера смешивают 611 мл раствора 1 и 389 мл раствора 2.
Перекись водорода, 30%
При постановке теста используют 30% раствор перекиси водорода, а не 3% раствор, который обычно получают из аптек. 30% раствор перекиси водорода (Н2О2) хранят в холодильнике.
При работе с раствором используют резиновые перчатки и защитный щиток для глаз.
Твин 80, 10%
Смешивают 10 мл Твин 80 с 90 мл дистиллированной воды и автоклавируют при 121°С в течение 10 минут. В процессе автоклавирования Твин 80 может образовать осадок, который можно растворить при покачивании флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения. Готовый раствор хранят в холодильнике.
Готовый каталазный реагент (смесь Твина 80 с перекисью водорода)
Непосредственно перед постановкой теста смешивают равные объемы 10% раствора Твина 80 и 30% раствора перекиси водорода. Для исследования каждого штамма требуется 1,0 мл каталазного реагента.
Контроли:
Капельный метод
В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом M. tuberculosis H37Rv, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.
Полуколичественный метод и тест на термостабильность каталазы при 68°С
В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля – пробирку с референс-штаммом M. terrae, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.
Методика:
Капельный метод
Для постановки теста используют двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена. В пробирку с ростом микобактерий добавляют 1–2 капли свежеприготовленной смеси Твина 80 с перекисью водорода (готовый каталазный реагент). Наблюдают в течение 5 минут, происходит ли образование пузырьков газа.
Результаты и их интерпретация:
Отрицательный результат - пузырьки газа не образуются
Положительный (медленный) результат - небольшое количество медленно образующихся пузырьков газа
Положительный (быстрый) результат - немедленное образование большого количества пузырьков газа
Полуколичественный метод
Для постановки теста используют двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена. В пробирку с ростом микобактерий добавляют 1 мл свежеприготовленной смеси твина-80 с перекисью водорода, плотно закрывают пробирку и оставляют на 5 минут при комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены.
Измеряют высоту этого столбика от уровня жидкости в пробирке до верхнего края пены
Результаты и их интерпретация:
Каталазная активность слабая или отсутствует - высота столбика пены менее 31 мм
Неопределенный результат - высота столбика пены от 31 мм до 45 мм
Высокая каталазная активность - высота столбика пены более 45 мм
7.2.1.4. Тест на термостабильность каталазы при 68°С и рН 7,0
Методика:
С помощью стерильной пипетки вносят с соблюдением правил асептики 0,5 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0) в пробирку размерами 16х125 мм с завинчивающейся крышкой. С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендируют в этом растворе исследуемую культуру микобактерий (использовать несколько петель биомассы).
Пробирки с бактериальными суспензиями помещают в предварительно нагретую водяную баню на 20 минут при температуре 68°С; температура и продолжительность инкубации имеют чрезвычайно важное значение.
Достают пробирки из водяной бани и оставляют при комнатной температуре до полного остывания.
Вносят в каждую пробирку 0,5 мл свежеприготовленной смеси Твина 80 с перекисью водорода и плотно закрывают пробки. Наблюдают за образованием пузырьков, появляющихся на поверхности жидкости. Нельзя встряхивать пробирку, так как при этом Твин 80 спонтанно образовывает пузырьки, что может стать причиной ложноположительного результата.
Пробирки с отрицательными результатами нельзя сбрасывать раньше, чем через 20 минут.
Результаты и их интерпретация:
Положительный результат - пузырьки газа образуются
Отрицательный результат - пузырьков газа нет
В редких случаях может наблюдаться небольшое количество пузырьков, поднимающихся от осадка бактериальных клеток; при этом пена в пробирке не образуется. В таких случаях результаты каталазного теста также считают положительными.
Гидролиз Твин 80
Принцип метода.Ферментативный гидролиз Твин 80 используется для определения потенциально патогенных видов (негативная реакция) от медленнорастущих скотохромогенных и нефотохромогенных сапрофитов (положительная реакция). Среда для исследования включает в себя Твин 80 и индикатор нейтральный красный (pH 7). В обычных условиях при pH 7 нейтральный красный красного цвета, но когда он связывается с липидами или Твин 80, индикатор становится янтарного или соломенного цвета, что показывает сдвиг pH в щелочную сторону. При энзимном гидролизе Твин 80 происходит освобождение нейтрального красного, и окраска восстанавливается от розовой до красной.
Реактивы
Фосфатный буфер, pH 7
a) Na2HPO4, 0067 М
Растворяют 9,47 г Na2HPO4 безводного в 1 л дистиллированной воды.
b) KH2PO4, 0,067 М
Растворяют 9,07 г KH2PO4 в 1 л дистиллированной воды.
Для приготовления 100 мл буферного раствора к 61,1 мл раствора «а» добавляют 38,9 мл раствора «b» и проверяют pH полученного раствора.
Субстрат среды
К 100 мл фосфатного буфера добавляют 0,5 мл Твин 80 и 2 мл 0,1 % водного раствора нейтрального красного. Полученный субстрат разливают в пробирки по 2 мл. Автоклавируют 10 минут при 121°C. После автоклавирования субстрат должен быть янтарного или соломенного цвета. Хранят в темном месте при 5°C не более 2 недель.
Контроли
Положительным контролем служит пробирка, засеянная M. kansasii.
Отрицательным контролем служит пробирка, засеянная M. bovis (BCG) или M. avium комплекс. В качестве отрицательного контроля можно использовать незасеянный субстрат.
Методика
Полную лопатку исследуемых микроорганизмов инокулировать в субстрат, инкубируют при 37°C.
Результаты учитывают на 1, 5 и 10 дни инкубирования. Регистрируют, на какой день цвет поменялся на розовый или красный. Не трясти пробирки при просмотре.