Тема 15. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АЛЛЕРГЕНОВ
Туберкулин. Впервые туберкулин был получен и применен в ветеринарной практике в России в 1888 г. Гельманом Х.И., затем для медицинских целей изготовлен Р.Кохом в 1890 г. Для диагностики туберкулеза отечественная биопромышленность выпускает несколько видов аллергенов: сухой очищенный ППД-туберкулин (Purified Protein Derative) - для млекопитающих, сухой очищенный ППД-туберкулин для птиц, альттуберкулин (АТК), КАМ-туберкулин, стандартный раствор ППД-туберкулина для млекопитающих.
| Культивирование произ-водственных штаммов |
| Получение бактериальной массы центрифуги-рованием |
| Получение полисахаридно-полипептидного комплекса |
| Консервирование эритроцитов |
| Получение эритроцитов |
| Подготовка овец-доноров |
| Сенсибилизация консервированных эритроцитов полисахаридной-полипептидной фракции сальмонелл |
| Разведение сенсибилизированных эритроцитов буфером |
| Расфасовка, маркировка, контроль |
Приготовление эритроцитарного диагностикума
Для приготовления ППД-туберкулина и альттуберкулина для диагностики туберкулеза млекопитающих используют производственные штаммы возбудителя туберкулеза бычьего вида.
1. Производственные штаммы возбудителя туберкулеза бычьего вида выращивают в модифицированной среде Соттона с аспарагином и лимонной кислотой в течение 2 месяцев.
2. Автоклавируют взвесь микобактерий.
3. Белок культуральной жидкости осаждают трихлоруксусной кислотой.
4. Центрифугируют и повторно осаждают белок сернокислым аммонием.
5. Надосадочную жидкость удаляют, а преципитат растворяют в воде и подвергают диализу для удаления остатков сернокислого аммония.
6. Раствор туберкулина подщелачивают и фильтруют.
7. Расфасовывают во флаконы объемом 10-20 мл и лиофильно высушивают.
8. Проводят контроль туберкулинов на растворимость, стерильность, рН, безвредность, специфичность и содержание туберкулиновых единиц (ТЕ). Активность выпускаемых серий ППД должна составлять 50000 ТЕ/мл.
Туберкулин представляет собой лиофильно высушенные белковые продукты метаболизма микобактерий и белки, извлеченные из клеток.
Комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ) готовят по типу ППД-туберкулинов для млекопитающих и птиц.
В качестве производственных штаммов используют наиболее часто мигрирующие на животноводческих фермах нефотохромогенные и скотохрамогенные микобактерии (штаммы Myc.serofulaccum-12 и Myc.intracellulare-13). Культуры этих штаммов поддерживают на картофельной среде Павловского и для изготовления аллергена адаптируют к синтетической питательной среде. Из 2-месячных культур готовят растворы моноаллергенов. Затем растворы моноаллергенов смешивают в разных количествах по содержанию ЕД и лиофилизируют. Комплексный аллерген выпускают во флаконах вместимостью 10 мл с содержанием 67500 ЕД.
Бруцеллин. Для приготовления бруцеллина используют производственный штамм Br. Abortus В-1.
1. Производственный штамм B. Abortus В-1 в S-форме и не вызывающий образования агглютининов при подкожном введении морским свинкам выращивают в биореакторе в питательной среде с 0,5% глюкозы при 37оС в течение 4-5 сут.
2. Культуру бруцелл прогревают до 105 - 110оС при работающей мешалке, затем охлаждают и центрифугируют.
3. Надосадочную жидкость (конденсат бруцеллина) фильтруют через стерилизующие пластины и собирают в стерильную емкость.
4. Бактерийную массу разбавляют физраствором 1:50 и стерилизуют при 105 - 110оС.
5. Надсадочную жидкость (экстракт бруцеллина) после стерилизующей фильтрации смешивают с ранее полученным концентратом бруцеллина, смесь разводят стерильным физраствором до необходимой концентрации бактериального белка, доводят рН до 7,2 – 7,4.
6. Приготовленную серию бруцеллина разливают во флаконы, закрывают пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками.
7. Флаконы стерилизуют в автоклаве при 105 – 110оС и выдерживают 3 сут в темостате при 37оС.
Конечный продукт – бруцеллин представляет собой стерильную, прозрачную жидкость светло-коричневого цвета, содержащую продукты жизнедеятельности (метаболизма) бруцелл и специфические вещества белковой природы, извлеченные из них.
Готовый препарат подвергают контролю на стерильность, содержание бактериального белка, концентрацию водородных ионов, безвредность, специфичность и активность.
Маллеин. Для изготовления маллеина используют штамм № 5584 возбудителя сапа.
1. Actinobacillus mallei № 5584 выращивают в мясо-пептонном глицериновом бульоне (МПГБ) в бутылях в течение 4 месяцев при 37оС.
2. Культуральную суспензию автоклавируют и отстаивают в течение 4 мес. при 20оС.
3. Надосадочную жидкость фильтруют через стерилизующие пластины.
4. Разливают в ампулы или флаконы, которые после закупорки стерилизуют автоклавированием.
5. Готовый препарат контролируют на стерильность, безвредность и специфичность.
Вышеизложенная технология получения бруцеллина, туберкулина, маллеина показывает, что несмотря на ряд технологических различий в их изготовлении, имеются и некоторые общие процессы. Эти препараты представляют собой культуральные жидкости, содержащие продукты метаболизма, автолизаты и экстракты возбудителей соответствующих заболеваний, подвергнутые автоклавированию.
Применение таких диагностических препаратов позволяет эффективно проводить противоэпизоотические мероприятия по ликвидации в стране бруцеллеза, туберкулеза, недопущению заболевания сапом животных и людей.