Определение активности нитратредуктазы

В растительной продукции

В большинстве почв, особенно окультуренных, довольно активно про-исходит процесс нитрификации, в ходе которого аммонийная форма азота, образующаяся в почве при распаде органических остатков, а также внесённая в виде удобрений, превращается в нитраты. Поступивший нитратный азот в растениях, прежде чем включиться в состав азотистых веществ, подвергается восстановлению в аммонийную форму с помощью специальных ферментных систем. На первом этапе под действием фермента нитратредуктазы происходит превращение нитратов в нитриты, а затем нитриты с участием фермента нитритредуктазы восстанавливаются с образованием аммонийной формы азота, которая используется для синтеза аминокислот, амидов и других азотистых веществ.

Нитратредуктазы высших растений, зелёных водорослей и грибов (1.6.6.1; 1.6.6.2; 1.6.6.3) представляют собой металлофлавопротеиды с моле-кулярными массами 200-330 тыс., включающие два типа субъединиц: имеющие флавиновые группировки (ФАД, ФМН) и содержащие молибдено-вый кофермент. Донором электронов для восстановления нитратного азота у растений служит НАД×Н, у грибов – НАДФ×Н. От восстановленных динук-леотидов электроны и протоны переходят на флавиновую группировку нитратредуктазы. Затем электроны передаются на цитохром в₅₅₇, служащий в составе фермента промежуточным переносчиком электронов от флавинового на молибденовый кофермент, а протоны высвобождаются и могут взаимо-действовать с анионами кислорода, которые образуются при восстановлении нитратного азота.

Молибденовый кофермент содержит катионы молибдена, лабильно связанного с ароматической группировкой, которая присоединяется к белко-вой части фермента. Катионы молибдена, обратимо изменяя степень окисле-ния, способны акцептировать электроны от цитохрома в₅₅₇ и передавать их на азот нитрата, который связывается с активным центром фермента. В резуль-тате восстановления азота нитрат превращается в нитрит, а высвобожда-ющийся анион кислорода О^2- соединяется с протонами, образуя молекулу воды. Механизм восстановления нитратов до нитритов под действием нитратредуктазы может быть представлен в виде следующей схемы:

У растений наиболее высокая нитратредуктазная активность обнару-живается в меристематических тканях. У большинства растений при актив-ном фотосинтезе и достаточном количестве углеводов, являющихся источни-ками образования НАД×Н, процесс восстановления нитратов практически полностью происходит в корнях. Однако при недостатке света и низких температурах, ослабляющих синтез углеводов, а также избыточном азотном питании значительная часть нитратов поступает в вегетативную часть растений и подвергается восстановлению в листьях. Вместе с тем известны растения, у которых практически не обнаруживается нитратредуктазной активности в корнях. У них превращение нитратного азота в аммонийный осуществляется в основном в листьях. К таким растениям относятся свёкла, хлопчатник, марь, дурнишник и др.

Нитратредуктаза – типичный индуцибельный фермент. Его активность резко возрастает при поступлении в растения нитратов вследствие того, что происходит индукция синтеза фермента. Когда же концентрация нитратов в клетках растений уменьшается, синтез ферментного белка прекращается и нитратредуктазная активность снова понижается до исходного уровня. Кроме нитратов, индукторами синтеза нитратредуктазы могут быть цитокинин и органические нитросоединения, то есть возможна индукция синтеза этого фермента под воздействием химических регуляторов. В то же время катионы аммония подавляют в растениях синтез нитратредуктазы.

Известны группы растений, имеющие природно невысокий уровень нитратредуктазной активности, вследствие чего они накапливают высокие концентрации нитратов. К таким видам относятся растения семейства тыквенные, шпинат, редька и др. Однако у большинства растений повышение содержания нитратов наблюдается при определённых неблаго-приятных условиях выращивания, связанных с недостатком световой энергии, низкой температурой, недостатком фосфора, калия, ряда микроэлементов, избыточными дозами азотных удобрений. Поэтому для каждой группы растительных продуктов установлена предельно допустимая концентрация нитратов.

При недостатке света ослабляются процессы фотосинтеза и дыхания, в результате чего понижается скорость образования восстановленных динук-леотидов и восстановленного ферредоксина, являющихся донорами электронов для восстановления нитратов, поэтому значительная часть нитратов остаётся невосстановленной и не используется для синтеза азотистых веществ растений. Аналогичное явление наблюдается в условиях пониженных температур, когда замедляются биосинтетические процессы, связанные с регенерацией доноров электронов для нитратвосстанавлива-ющей системы, тогда как поступление нитратов в растения продолжается, вследствие чего их концентрация в растительных тканях увеличивается.

Заметное влияние на функционирование нитратвосстанавливающей системы растений оказывает обеспеченность их микроэлементами – молибденом, железом, магнием, марганцем, медью, которые служат активаторами нитратредуктазы, нитритредуктазы и других ферментов азотного обмена. Особенно важна роль молибдена, входящего в состав молибденового кофермента нитратредуктазы. При недостатке молибдена и других микроэлементов замедляется процесс восстановления нитратов и происходит их накопление в растительных продуктах. Ещё большее накопление нитратов в растениях наблюдается при внесении избыточных доз азотных удобрений, а также при низкой обеспеченности растений фосфором и калием, когда формируется низкий урожай, и в этих условиях даже умеренные дозы азотных удобрений могут оказаться избыточными.

Принцип метода.Метод основан на колориметрическом определении нитритов, которые образуются из нитратов под действием фермента нитратредуктазы в соответствии с реакцией:

NO₃‾ + НАД×Н + Н⁺ ¾® NO₂‾ + НАД⁺ + Н₂О

Оборудование.Фарфоровые ступки с пестиками диаметром 8-10 см; лабораторные весы; фарфоровые чашки диаметром 6-8 см; марля для фильтрования; стеклянные пробирки на 20 мл со штативами; мерные колбы на 50, 100, 500, 1000 мл; конические колбы на 50 мл; дозирующие пипетки на 1-10 мл; термостат; фотоэлектроколориметр с набором кювет; дозирующее устройство для уксусной кислоты на 1 мл; стеклянные воронки диаметром 5 см; бумажные фильтры диаметром 6 см.

Реактивы.Дигидрофосфат натрия; гидрофосфат натрия; нитрат калия;

НАД∙Н; концентрированная уксусная кислота; сульфат аммония; сульфаниловая кислота; α-нафтиламин; нитрит натрия; дистиллированная вода (свободная от диоксида углерода).

Приготовление растворов.0,05 М фосфатный буфер (рН=8,0): в 1 л дистиллированной воды растворяют 17,911 г Na₂HPO₄∙12Н₂О; в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,780 г NaН₂РО₄∙2Н₂О. Затем 53 мл раствора NaН₂РО₄∙2Н₂О смешивают с 947 мл раствора Na₂HPO₄∙12Н₂О.

0,1 М раствор нитрата калия: 5,055 г нитрата калия растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 500 мл.

0,028 М раствор НАД∙Н: 1,86 г НАД∙Н растворяют 0,05 М фосфатным буферным раствором в мерной колбе на 100 мл.

10% раствор уксусной кислоты: 97,1 мл концентрированной уксусной кислоты расворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л.

Насыщенный раствор сульфата аммония: в 500 мл горячей воды (70°С) растворяют сульфат аммония до полного насыщения раствора, затем полученный раствор охлаждают, фильтруют и переливают в склянку для хранения.

Реактив Грисса: 4,8 г сульфаниловой кислоты и 2,4 г α-нафтиламина растворяют в 10%-ной уксусной кислоте и доводят объём раствора до 1 л.

Стандартный раствор нитрита натрия: 100 мг нитрита натрия расворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л.

Ход определения.В фарфоровую ступку помещают 2 г растительного материала (проростки семян, вегетативная масса растений, клубни карто-феля, корнеплоды, овощи, плоды, ягоды) и растирают пестиком с небольшим количеством кварцевого песка до получения однородной массы. Затем в ступку приливают 20 мл фосфатного буферного раствора (рН=8,0) и смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. После этого полученную суспензию отжимают в фарфоровую чашку через 4 слоя марли и таким образом получают ферментный экстракт.

В ходе дальнейшего анализа отбирают дозирующей пипеткой 2 аликво-ты ферментного экстракта по 2 мл и переносят в стеклянные пробирки на 20 мл. В одну из пробирок приливают 1 мл 10% раствора уксусной кислоты для инактивации фермента и содержимое пробирки перемешивают. Затем в эту же пробирку приливают 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония для осаждения белков и содержимое пробирки снова перемешивают. После этого в обе пробирки (с активным и инактивированным ферментом) приливают по 1 мл 0,1 М раствора нитрата калия и 0,028 М раствора НАД∙Н, содержимое пробирок перемешивают и ставят на 30 минут в термостат при температуре 27°С. При этом фиксируют точное время начала ферментативной реакции.

По истечении указанного времени в пробирку с активным ферментом для его инактивации приливают 1 мл 10% раствора уксусной кислоты, а пос-ле перемешивания 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Получен-ную смесь повторно перемешивают и отстаивают в течение 10 минут. В дальнейшем содержимое пробирок фильтруют в конические колбы на 50 мл. Из каждого фильтрата отбирают дозирующей пипеткой аликвоты по 5 мл и переносят в стеклянные пробирки. К фильтрату в каждой пробирке прилива-ют по 1 мл реактива Грисса и содержимое пробирок перемешивают. Через 30 минут окрашенные растворы колориметрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм и толщине фотометрируемого слоя 1 см.

Для построения градуировочного графика берут 10 мерных колб вмес-тимостью 50 мл и приливают 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0 мл исходного стандартного раствора нитрита натрия в каждую. Объёмы раство-ров в колбах доводят дистиллированной водой до метки и их содержимое перемешивают. Из каждой колбы пипеткой переносят в стеклянные пробир-ки по 5 мл раствора нитрита натрия и приливают по 1 мл реактива Грисса, содержимое пробирок перемешивают и через 30 минут колориметрируют окрашенные растворы на фотоэлектроколориметре. По полученным данным строят градуировочный график: на горизонтальной оси откладывают коли-чество мкг нитрита натрия в 5 мл внесённого для окрашивания раствора (соответственно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мкг), а на вертикальной оси – оптическую плотность окрашенных растворов.

Обработка и оценка результатов.Активность нитратредуктазы вычисляют по формуле:

М ∙ 20 ∙ 8

А = ¾¾¾¾¾ ,

Н ∙ 2 ∙ 5 ∙ t

где А – активность нитратредуктазы в мкг нитрита натрия, который образу-ется под действием фермента за 1 час, в расчёте на 1 г растительной массы;

М – масса нитрита натрия, определённая по градуировочному графику на основе оптической плотности окрашенного раствора, мкг;

20 – объём ферментного экстракта, полученный из навески раститель-ного материала, мл;

8 – объём реакционной смеси при проведении ферментной реакции, мл;

Н – навеска растительного материала, г;

2 – объём ферментного экстракта, взятый для проведения фермента-тивной реакции, мл;

5 – объём фильтрата реакционной смеси, взятый для окрашивания с реактивом Грисса, мл;

t – время ферментной реакции в часах.

Полученный результат сравнивают с другими данными, характеризую-щими активность нитратредуктазы в разных растительных продуктах, выра-щенных при разном уровне азотного питания растений, при разной обеспе-ченности растений световой энергией и элементами питания. По уровню нитраредуктазной активности оценивают возможное содержание нитратов в растительной продукции.

Контрольные вопросы

1. Каковы строение и свойства ферментного белка нитратредуктазы?

2. Каков механизм действия нитратредуктазы?

3. Как различаются разные группы растений по уровню нитратредук-тазной активности?

4. Почему повышается содержание нитратов в растительной продукции при недостатке световой энергии и при низких температурах?

5. Почему повышается содержание нитратов в растительной продукции при избыточном азотном питании и недостатке других элементов питания?

6. Каковы принципы определения активности нитратредуктазы?

7. Как получают ферментный экстракт нитратредуктазы из раститель-ной пробы?

8. В чём состоят особенности проведения ферментной реакции с участием нитратредуктазы?

9. Как определяется количество нитритов, образующихся под действием фермента нитратредуктазы?

10. Какова методика построения градуировочного графика при опре-делении активности нитратредуктазы?

11. Каковы принципы расчёта активности нитратредуктазы в расти-тельной продукции?